球孢白僵菌（Beauveria bassiana）是當(dāng)前世界上研究和應(yīng)用最廣泛的生防真菌之一，已被開發(fā)成為多種制劑用于農(nóng)林害蟲的生物防治。作為典型的絲狀昆蟲病原真菌，良好的菌絲生長狀態(tài)是保證球孢白僵菌完整、穩(wěn)定完成生活史及宿主侵染的重要前提。因此，對(duì)影響球孢白僵菌菌絲生長的功能基因研究多年來仍方興未艾。
生長是球孢白僵菌重要的生防潛能指標(biāo)之一，影響球孢白僵菌生活史進(jìn)程，在球孢白僵菌侵染過程中，減緩菌絲生長速率可通過延緩產(chǎn)孢、緩慢侵染從而降低微生物殺蟲劑的生防效力。因此，對(duì)調(diào)控球孢白僵菌生長速率的基因功能研究具有重要的理論及應(yīng)用意義。近年來，已有眾多影響球孢白僵菌生長的基因或蛋白相繼被發(fā)現(xiàn)，包括MAPK激酶Pbs2、Mkk1和Ste7；熱休克轉(zhuǎn)錄因子Hsf1、Sfl1以及Skn7；細(xì)胞質(zhì)60S前亞基輸出因子BbRei1及WSC1蛋白等，這些蛋白的缺失均引起球孢白僵菌菌落生長速率遲緩。
小GTP酶作為調(diào)控細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)途徑的分子開關(guān)，行使各種生物學(xué)功能，包括細(xì)胞極性生長、細(xì)胞形態(tài)發(fā)生、細(xì)胞分裂等。在我們之前的工作中，已成功構(gòu)建球孢白僵菌小GTP酶Ras3和Miro單基因敲除菌株，并檢測(cè)了它們對(duì)球孢白僵菌菌絲生長速率的影響。在SDAY和1/4 SDAY培養(yǎng)基上，ras3缺失菌株Δras3顯示出增強(qiáng)的菌絲生長速率，表明Ras3負(fù)調(diào)控球孢白僵菌菌絲生長速率。與此不同，Miro調(diào)控球孢白僵菌細(xì)胞內(nèi)線粒體總量、分布及ATP含量，而Miro功能缺失引起球孢白僵菌菌絲生長速率減緩。在本實(shí)驗(yàn)中，成功構(gòu)建球孢白僵菌Rho5蛋白單基因缺失菌株ΔBbrho5及其對(duì)應(yīng)回補(bǔ)菌株ΔBbrho5∷ΔBbrho5。在SDAY、1/4 SDAY及貧瘠培養(yǎng)基CZA培養(yǎng)基上，ΔBbrho5均表現(xiàn)出受抑制的菌絲生長速率：在富營養(yǎng)培養(yǎng)基SDAY和1/4 SDAY上，ΔBbrho5生長速率相比于野生株下降了10.45%和19.30%；在貧瘠培養(yǎng)基上，ΔBbrho5生長速率相比于野生株下降了9.09%。以上結(jié)果表明，小GTP酶對(duì)球孢白僵菌生長速率的調(diào)節(jié)可能是多向的，因基因不同而異，BbRho5正向調(diào)控球孢白僵菌菌絲生長速率，這和Miro蛋白功能缺陷引起的表型類似。
提取ΔBbrho5及WT菌株RNA，借助Illumina Hiseq測(cè)序平臺(tái)完成轉(zhuǎn)錄組測(cè)序并對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。
Bbrho5單基因缺失對(duì)球孢白僵菌生長速率、多菌靈耐受性及生物防治能力的影響分別刮取野生菌株WT、敲除菌株ΔBbrho5、回補(bǔ)菌株ΔBbrho5∷Bbrho5的分生孢子懸液，分散于吐溫-80液體中，將濃度調(diào)整為1×107個(gè)/mL，懸液均勻涂布于貼有玻璃紙的SDAY平板上，在25℃和光周期12 h∶12 h條件下培養(yǎng)3 d后，用打孔器鉆取直徑5 mm的菌絲圓片，貼于SDAY、1/4 SDAY或CZA平板上，在25℃和12 h∶12 h條件下培養(yǎng)7 d后，用十字交叉法測(cè)量各菌落直徑（cm），作為菌落生長速率的指標(biāo)。
Bbrho5單基因缺失對(duì)球孢白僵菌生長速率、多菌靈耐受性及生物防治能力的影響
在富營養(yǎng)培養(yǎng)基SDAY和1/4 SDAY上，ΔBbrho5生長速率相比于野生株下降了10.45%和19.30%。在貧瘠培養(yǎng)基上，ΔBbrho5生長速率相比于野生株下降了9.09%。以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，Bbrho5缺失會(huì)引起球孢白僵菌生長速率減緩（圖1）。
野生菌株、敲除菌株和回補(bǔ)菌株的生長速率測(cè)定
此外，Bbrho5缺失對(duì)球孢白僵菌多菌靈耐受性及生物防治能力的影響也被檢測(cè)。結(jié)果表明，不同于Bbrho5對(duì)生長的顯著影響，Bbrho5缺失菌株在多菌靈脅迫條件下，菌落生長直徑僅略微下降11%（圖2-A）。以大蠟螟幼蟲為試蟲探究Bbrho5缺失對(duì)球孢白僵菌毒力的影響，結(jié)果表明，ΔBbrho5對(duì)大蠟螟體壁侵染的致死中時(shí)LT50相比于野生菌株WT同樣表現(xiàn)出略微的延遲（5.07%）（圖2-B）。
球孢白僵菌對(duì)多菌靈的耐藥性（A）及對(duì)大蠟螟的生物防治能力（B）
結(jié)果表明，ΔBbrho5vs WT共獲得顯著差異表達(dá)基因（DEGs）770個(gè)，其中顯著上調(diào)基因有395個(gè)，顯著下調(diào)基因有375個(gè)。對(duì)ΔBbrho5vs WT基因集中的DEGs進(jìn)行GO功能富集分析，結(jié)果表明DEGs功能主要富集于分子功能部分（molecular function，MF），其中氧化還原酶活力（oxidoreductase activity）和單加氧酶活力（monooxygenase activity）功能極為顯著。在生物進(jìn)程部分（biological process，BP），氧化還原過程（oxidation-reduction process）和跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)（transmembrane transport）最為顯著。通過KEGG富集通路分析，結(jié)果表明，ΔBbrho5vs WT的DEGs顯著差異代謝通路最主要富集在氮代謝（nitrogen metabolism），此外，也有多數(shù)基因富集到甘氨酸/絲氨酸和蘇氨酸的代謝、丙氨酸/天冬氨酸/谷氨酸代謝、色氨酸代謝、酪蛋白氨基酸、精氨酸生物合成、苯丙氨酸代謝、酪氨酸代謝等氨基酸代謝途徑。在微生物細(xì)胞中，氮源需要轉(zhuǎn)變?yōu)楣劝彼岷凸劝滨０凡拍苓M(jìn)一步被利用，因此，谷氨酸和谷氨酰胺在氮代謝中發(fā)揮著重要作用。谷氨酸合酶被證明可正向調(diào)控靈芝菌絲生長，谷氨酰胺合成酶是一個(gè)重要的氮源調(diào)節(jié)因子，影響微生物對(duì)氮源及能源的利用。在刺糖多孢菌中，谷氨酰胺合成酶基因的敲除同樣引發(fā)顯著的生長抑制。在ΔBbrho5vs WT的DEGs中，富集到氮代謝通路中的功能基因有7個(gè)，其中5個(gè)上調(diào)，2個(gè)下調(diào)，說明敲除菌株可能采用增強(qiáng)氮源利用以應(yīng)對(duì)Bbrho5缺陷引起的生長遲緩。在上調(diào)基因中，包含了重要的谷氨酸合酶（glutamate synthase）基因和谷氨酰胺合成酶（glutamine synthetase）基因，這在轉(zhuǎn)錄水平上揭示了ΔBbrho5細(xì)胞內(nèi)谷氨酸合成水平增強(qiáng)，暗示ΔBbrho5可能通過調(diào)節(jié)上升的氮代謝，進(jìn)而促進(jìn)谷氨酸合成，以應(yīng)對(duì)生長速率減弱的生防潛能缺陷。
結(jié)論
本研究成功構(gòu)建球孢白僵菌Bbrho5單基因缺失菌株ΔBbrho5，Bbrho5單缺失能夠引起球孢白僵菌的顯著生長缺陷，并對(duì)球孢白僵菌抗多菌靈能力及其生物防治能力效果極微。轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)分析表明ΔBbrho5可能通過氮代謝及多種氨基酸代謝作為響應(yīng)通路調(diào)節(jié)菌體的生長速率。
相關(guān)新聞推薦
1、基于β-半乳糖苷酶Lac Z的UPR響應(yīng)指示菌株的構(gòu)建及生長曲線測(cè)定——討論