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同為酵母,不同來源、不同遺傳背景菌株的基本特性彼此差異巨大,決定異源蛋白分泌途徑表達效率的,除異源蛋白自身特性和表達載體系統(tǒng)外,酵母自身基于蛋白質質量控制系統(tǒng)調控的分泌能力是至關重要的。整體上酵母抗逆性強、生長快易培養(yǎng)、有翻譯后修飾,能分泌到胞外,但其天然地只分泌少數幾種酶,從而進化出相對低的分泌容量。而在利用木質纖維素發(fā)酵產醇的體系里,同時具有高分泌能力、高發(fā)酵能力和對各種抑制物的良好耐受性的微生物菌種無疑是最理想的。
本研究中,An-a源自工業(yè)菌株,具有較實驗室菌株W303-1A更強的產醇性能;但前期研究發(fā)現其分泌表達的纖維素酶酶活性遠遠低于菌株W303-1A。本研究以26bp UPRE和CYC1基因起始密碼子上游250bp序列組合而成的雜合啟動子控制下的lacZ為報告基因來構建UPR響應指示菌株,考察將菌株對各種可能刺激源的UPR響應量化并進而比較的可行性。而研究結果證明了兩個菌株對乙酸、乙醇、衣霉素和β-葡萄糖苷酶表達的UPR響應差異極為顯著(圖5、圖6):菌株An-a對乙醇刺激的響應最強,次之衣霉素和乙醇與乙酸的混合物;菌株W303-1A則對衣霉素和基因表達的響應最強,LacZ酶活絕對值也遠遠高于菌株An-a相應值。這與我們前期的觀察結果一致,即兩個菌株相比較而言,菌株An-a產醇耐醇性能突出,而菌株W303-1A處理未折疊/錯誤折疊蛋白的能力強、有更高的蛋白質生產和分泌容量。
這里,衣霉素處理和β-葡萄糖苷酶表達都通過在ER中積累未折疊/錯誤折疊蛋白信號而激活UPR;根據西班牙Elisabet NT等人的研究,乙醇則通過改變細胞膜流動性激活UPR途徑。0.3%(v/v)乙酸處理沒有檢測到明顯的信號,與文獻報道不同;分析可能的原因,一是菌株差異,二是培養(yǎng)和分析條件不一致,乙酸濃度不合適,有待調整。
需要說明的是,當前一般選擇以RNA為基礎的Northern方法或RT-PCR方法,通過檢測HAC1 mRNA來檢查UPR激活與否,HAC1 mRNA的剪切被認為是內質網壓力的典型標志?；谙旅娴脑?本研究嘗試先建立方便、快速的UPR響應平板定性篩檢和液體培養(yǎng)定量檢測的方法,報告基因包括lac Z、gfp、mCherry等。以lac Z為報告基因的優(yōu)勢在于:能方便地進行平板顯色檢測;酶活測定方法背景低、適用范圍廣、無需特殊設備,且細胞樣品能凍存、時效性要求相對低。另外,釀酒酵母細胞除了依賴于Ire1和Hac1誘導的UPR應答,還包括不依賴于Ire1和Hac1誘導的UPR應答;UPRE啟動子控制下的報告基因方法能實現更寬范圍的篩檢。
為了更準確地判斷UPR激活情況,更重要的,是進一步深入分析UPR激活的具體途徑和調控規(guī)律,在前面篩檢基礎上進行RNA為基礎的分析,是必不可少的工作,目前相關的分析也正在進行中,后續(xù)會有進一步的報道。另一方面,鑒于衣霉素是最常用的UPR激活強效應劑,本研究設置的衣霉素處理對照的響應相對值,也提供了其它處理下UPR激活與否及響應值可靠性的有效參照。
綜上,本研究建立的LacZ酶活指示方法能滿足初步定性與定量檢測UPR響應的實驗需求,有望用于不同菌株、不同抑制性理化因子和不同異源基因表達的UPR響應的量化考察和對比評價,為尋找蛋白表達關鍵制約因素、優(yōu)化酵母ER和UPR信號通路的調控奠定基礎。
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