雌馬酚（equol）是1932年Marrian等在懷孕雌馬的尿液中分離羥雌酮時發(fā)現(xiàn)的，并確定分子式為C15H14O3。1982年Axelson等在普通人的尿液中發(fā)現(xiàn)了雌馬酚，還證明人在攝入大豆異黃酮后能在腸道菌的參與下降解產(chǎn)生雌馬酚。雌馬酚經(jīng)尿和膽汁排泄，排出濃度存在個體差異，受大豆異黃酮種類、腸道菌群多樣性、膳食成分等因素的影響，其中主要取決于腸道微生物菌群的組成及代謝能力。Kenneth等通過對41名青年人包括29名素食者和12名非素食主義者進行了研究，用質(zhì)譜方法（mass spectrometer，MS）分析血清和尿液中大豆苷元和雌馬酚濃度，發(fā)現(xiàn)在素食者中雌馬酚產(chǎn)生者為59%，比非素食者高出25%。
近些來，對以人糞樣為樣本分離大豆異黃酮降解菌的研究發(fā)展較快，通過對培養(yǎng)條件的優(yōu)化和控制，獲得多種不同代謝特性的厭氧型降解菌，且多為革蘭氏陽性桿菌。2007年Uchiyama等成功分離出乳酸球菌20-92、真桿菌7-430和梭菌20-197，能將大豆素（daidzein）直接轉(zhuǎn)化為雌馬酚；Jin等在2008年分離得到菌株PUE和DZE，PUE能將葛根素轉(zhuǎn)化為大豆素，DZE能將大豆素和染料木素（genistein）分別轉(zhuǎn)化為Equo和15-OH-equol。Tamura等于2006年分離得到的TM-40菌株，不能直接將大豆素轉(zhuǎn)化為雌馬酚，只具有將大豆苷（daidzin）和大豆素轉(zhuǎn)化為雙氫大豆素（dihydrodaidzein，DHD）的能力。在前期的研究中，采集了6位女性素食志愿者的糞樣作為樣本，從中培養(yǎng)分離出LJ-G1和LJ-Q2兩株腸道菌，均為厭氧菌，LJ-G1為革蘭氏陰性桿菌，LJ-Q2為革蘭氏陽性球菌，純培養(yǎng)均具有代謝大豆異黃酮產(chǎn)雌馬酚的能力。
目前雌馬酚的體外獲得主要通過兩種途徑，一是將大豆苷元從大豆中提取出后，在催化劑的作用下還原合成雌馬酚，另一種是篩選出雌馬酚產(chǎn)生菌，進行體外培養(yǎng)，以大豆苷元為底物，從培養(yǎng)液中得到雌馬酚。前者成本較高，不利于雌馬酚的廣泛應用，因此利用微生物發(fā)酵法生產(chǎn)雌馬酚具有廣闊的前景。本研究在前期工作基礎上，研究素食者產(chǎn)雌馬酚腸道菌生長規(guī)律、優(yōu)化菌株生長條件，為后續(xù)菌株降解大豆異黃酮的代謝研究，開發(fā)以生物發(fā)酵法制備雌馬酚提供科學參考。
1材料與方法
1.1菌種與試劑
菌種：LJ-G1和LJ-Q2由黑龍江省高校食品科學與工程重點實驗室自素食者糞便分離保藏。
大豆異黃酮（純度80%）西安市天園生物制藥廠；雌馬酚標準品（純度98%）合肥蘭旭生物有限公司；BHI肉湯培養(yǎng)基青島海博生物技術有限公司；瓊脂粉上海山醫(yī)學化驗所試劑廠；乳糖、麥芽糖、蔗糖、果糖、葡萄糖天津市化學試劑一廠；硫酸錳、硫酸鋅、氯化鈣、碳酸鈉、硝酸鉀吉林宏久試劑廠。
1.2儀器與設備
YQX-Ⅱ型培養(yǎng)箱上海新苗醫(yī)療機械有限公司；超潔凈工作臺上海凈化設備有限公司；LDZX-30KBS立式壓力蒸汽滅菌器上海申安醫(yī)療器械廠；循環(huán)水式真空泵鞏義市予華儀器有限責任公司；電熱恒溫鼓風干燥箱上海恒科學儀器有限公司；TU-1900型雙光束紫外分光光度計北京普析通用儀器有限公司。
1.3方法
1.3.1添加大豆異黃酮培養(yǎng)基制備及菌種活化
本實驗所用器皿均在干燥箱內(nèi)經(jīng)150℃、3 h干熱滅菌，液態(tài)試劑均在壓力蒸汽滅菌器內(nèi)經(jīng)102.9 kPa，20 min濕熱滅菌，無菌操作在超凈工作臺下完成。
稱取9.5 g BHI肉湯培養(yǎng)基溶于250 mL蒸餾水中，調(diào)節(jié)pH 7.4，加入質(zhì)量濃度為5 mg/mL的大豆異黃酮溶液，使其終質(zhì)量濃度為0.75 mg/mL。取保存于斜面的LJ-G1和LJ-Q2菌株，將供試菌種分別接種于BHI肉湯培養(yǎng)基中，置于37℃厭氧培養(yǎng)12 h。取活化好的菌種斜面，用無菌生理鹽水配制菌懸液，采用平板計數(shù)法調(diào)制菌懸液濃度為106～107CFU/mL，備用。
1.3.2腸道菌生長曲線的測定
生長曲線的測定采用活菌計數(shù)法。將活化后的菌液接種于裝有BHI液體培養(yǎng)基的試管中（n=3），接菌量體積分數(shù)5%，在48 h內(nèi)每隔3 h跟蹤測定活菌數(shù)，并根據(jù)這些實驗數(shù)據(jù)繪制生長曲線，進行分析，以便更好的掌握和利用其生長規(guī)律。按公式（1）計算菌數(shù)。
式中：S為培養(yǎng)基中總活菌數(shù)/（CFU/mL）；X1、X2、X3為同一稀釋度菌落數(shù)/（CFU/mL）；N為菌落稀釋倍數(shù)。
1.3.3雌馬酚測定方法
雌馬酚定量測定采用紫外法，將固體培養(yǎng)基用80%乙醇溶液充分溶解后，活性炭脫色6 h、過濾，用聚酰胺樹脂進行純化，5 h后收集純化液，以80%乙醇溶液定容，205 nm波長處測定OD值?；貧w方程為：y=0.174 04x＋0.006 23（R2=0.996 9）。按公式（2）計算培養(yǎng)基中雌馬酚含量。
式中：ρ1為培養(yǎng)基中雌馬酚質(zhì)量濃度/（μg/mL）；V1為培養(yǎng)基體積/mL；V2為定容后體積/mL；ρ2為回歸方程計算得到的雌馬酚質(zhì)量濃度/（μg/mL）。
1.3.4不同種類的金屬鹽及其濃度對腸道菌生長的影響
向BHI液體培養(yǎng)基中分別添加MnSO4、ZnSO4、CaCl2、Na2CO3、KNO3溶液，使其濃度（以培養(yǎng)基體積計）分別達到0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 mol/L，再將活化后的LJ-G1和LJ-Q2的菌液按體積分數(shù)5%接種于BHI液體培養(yǎng)基中，37℃厭氧培養(yǎng)36 h，以只接菌未添加金屬鹽的培養(yǎng)基作為對照，BHI液體培養(yǎng)基最大吸收波長為460 nm，因而在此波長處測定光密度（OD）值（n=3），考察各金屬鹽及不同濃度對腸道菌生長的影響。
1.3.5不同碳源對腸道菌的影響
選取葡萄糖、麥芽糖、蔗糖、果糖、乳糖5種碳源，分別添加于BHI培養(yǎng)基中，質(zhì)量濃度（以培養(yǎng)基體積計）達到10 g/L，以不添加糖為對照。分別接種稀釋度為10-5的LJ-G1和LJ-Q2菌液各0.2 mL，倒置放入?yún)捬跸渲校?7℃培養(yǎng)36 h后，采用活菌計數(shù)法計數(shù)（n=3）。
1.3.6生長條件單因素試驗
單因素試驗主要考慮葡萄糖質(zhì)量濃度、pH值、NaCl質(zhì)量濃度這3個因素，在BHI固體培養(yǎng)基上，基礎培養(yǎng)條件為葡萄糖質(zhì)量濃度（以培養(yǎng)基體積計）7 g/L、pH 7、NaCl質(zhì)量濃度（以培養(yǎng)基計）4 g/L。接種、培養(yǎng)條件、評價指標按1.3.5節(jié)操作，考察各因素適宜范圍。
1.3.7菌株生長條件正交試驗
根據(jù)單因素試驗結(jié)果，采用L9（34）進行正交試驗，以雌馬酚產(chǎn)量為評價指標，優(yōu)化生長條件。試驗中的各組平行試驗結(jié)果的差異顯著性檢驗均采用常用的統(tǒng)計方法F檢驗法。
素食者產(chǎn)雌馬酚腸道菌生長規(guī)律及生長條件優(yōu)化（一）
素食者產(chǎn)雌馬酚腸道菌生長規(guī)律及生長條件優(yōu)化（二）
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