2結(jié)果與討論
圖1不同濃度的Amp(a)、Cmp(b)、Kan(c)及Tet(d)處理對萊茵衣藻生長的影響
目前，用于微藻無菌化處理研究所使用的抗生素種類多樣，但針對于不同微藻所使用的抗生素種類及其施加劑量不同，其抑菌的效果也不同。抗生素既可以通過與微藻的某些成分結(jié)合，直接作用于藻體，從而改變微藻的生理生化性質(zhì)，造成微藻生長狀態(tài)的改變，又可以通過抑制與微藻共生的伴生菌的生長，從而間接影響藻類的生長。本研究根據(jù)抗生素在抗菌機(jī)制和抗菌譜上的差別，選擇了基因工程中常用的4種抗生素Amp、Cmp、Kan及Tet應(yīng)用于萊茵衣藻的無菌化研究，通過生長曲線、葉綠素a含量、光化學(xué)活性等指標(biāo)并結(jié)合4種抗生素的抑菌效果來探究4種抗生素對萊茵衣藻生長及光合作用的影響。
2.1不同抗生素對萊茵衣藻生長的影響
經(jīng)抗生素處理7 d后，萊茵衣藻生長狀況如圖1所示。由圖1(a)可知：當(dāng)Amp的處理質(zhì)量濃度為50及100μg/mL時，對萊茵衣藻的生長有顯著的促進(jìn)作用(P<0.05)，其中100μg/mL促進(jìn)生長的效果高于50μg/mL；當(dāng)Amp處理質(zhì)量濃度為120μg/mL時，對萊茵衣藻的生長有輕微的抑制作用；當(dāng)處理質(zhì)量濃度達(dá)到140μg/mL時，則顯著抑制萊茵衣藻的生長(P<0.05)。由圖1(b)可知：不同濃度的Cmp處理對萊茵衣藻的生長均有顯著促進(jìn)作用；當(dāng)Cmp質(zhì)量濃度為5μg/mL時，就表現(xiàn)出明顯的促進(jìn)作用(P<0.05)，濃度越高，促進(jìn)生長的效應(yīng)越顯著。由圖1(c)可知：當(dāng)Kan的處理質(zhì)量濃度為10μg/mL時，對萊茵衣藻的抑制作用已達(dá)到顯著(P<0.05)，7 d后，藻液變黃，當(dāng)Kan的終質(zhì)量濃度為20μg/mL時，極顯著抑制萊茵衣藻的生長(P<0.01)，藻液7 d后變透明，鏡檢結(jié)果顯示藻細(xì)胞內(nèi)部中空，幾乎全部死亡。由圖1(d)可知：Tet質(zhì)量濃度為5μg/mL時，表現(xiàn)出對萊茵衣藻的生長具有顯著抑制作用(P<0.05)，隨著Tet濃度的增加，抑制萊茵衣藻生長的作用更加明顯，藻液顏色逐漸變黃并且加深，7 d后鏡檢結(jié)果顯示，藻細(xì)胞內(nèi)部中空，幾乎全部死亡。
圖2不同濃度的Amp(a)、Cmp(b)、Kan(c)及Tet(d)處理對萊茵衣藻葉綠素a含量的影響
不同抗生素對于微藻的毒性效應(yīng)有所不同，而不同微藻種類對于抗生素的敏感性也有差異。在先前的研究中發(fā)現(xiàn)，氨芐青霉素、卡那霉素及鏈霉素的質(zhì)量濃度都小于200μg/mL時，對綠色巴夫藻(Pavlovaviridis)的生長有顯著促進(jìn)作用，而在質(zhì)量濃度分別低于800、500及200μg/mL時，對米氏凱倫藻(Kareniamikimotoi)有促進(jìn)作用，但如果分別高于此質(zhì)量濃度，則表現(xiàn)出顯著的抑制作用，可見不同藻類對于不同抗生素及不同的質(zhì)量濃度的響應(yīng)程度及閾值都存在較大差異。在本研究中，4種抗生素處理對萊茵衣藻的細(xì)胞密度存在著較大差異，Amp的低濃度(50和100μg/mL)處理及Cmp各濃度(低于20μg/mL)的處理，促使藻細(xì)胞密度增加，表明低濃度的Cmp和Amp基本上對萊茵衣藻細(xì)胞無毒性，另外，由于抗生素的加入會殺死藻液中的部分抑生菌，從而促使藻細(xì)胞生長的速度加快；Kan及Tet各濃度的處理，都會抑制藻細(xì)胞密度的增加，處理的后期會完全殺死藻細(xì)胞。對于萊茵衣藻等綠藻來說，諸如Amp等抑制細(xì)菌細(xì)胞壁合成的β-內(nèi)酰胺類的抗生素對藻細(xì)胞基本無毒性，而諸如Kan、Tet及Cmp等抑制蛋白質(zhì)合成作用的抗生素對藻細(xì)胞具有較高的毒性，但在本研究中，低濃度的Cmp(低于20μg/mL)卻沒有表現(xiàn)出對萊茵衣藻的毒性，可能是因為抑制蛋白質(zhì)合成的抗生素主要通過與原核生物線粒體的小亞基結(jié)合來抑制其生長及繁殖，在微藻等光合生物中，由于葉綠體在結(jié)構(gòu)上與線粒體相似，這類抗生素可能與葉綠體作用，從而抑制蛋白質(zhì)合成等代謝過程。而Cmp主要和細(xì)菌中的核糖體50S大亞基結(jié)合，抑制肽酰轉(zhuǎn)移酶的活性，從而阻止蛋白質(zhì)的合成，并最終導(dǎo)致細(xì)胞死亡，可能是因為Cmp在萊茵衣藻細(xì)胞內(nèi)沒有相應(yīng)的結(jié)合位點，從而導(dǎo)致無毒性或者毒性不明顯。鑒于原核和真核細(xì)胞還存在著本質(zhì)上的差別，因此抗生素的抑菌作用機(jī)制在綠藻等真核細(xì)胞內(nèi)并非和原核生物是直接對應(yīng)的，其抗生素和微藻之間相互作用的機(jī)制還有待進(jìn)一步研究。
2.2不同抗生素對萊茵衣藻葉綠素a含量的影響
不同種類及濃度的抗生素處理過程中，葉綠素a含量的變化如圖2所示。由圖2(a)可知：當(dāng)Amp的處理質(zhì)量濃度為50及100μg/mL時，萊茵衣藻的葉綠素a含量顯著高于未處理組，其中100μg/mL的Amp的處理含量增加得更明顯；當(dāng)藻液中Amp終質(zhì)量濃度為120及140μg/mL時，萊茵衣藻的葉綠素a的含量低于對照組。由圖2(b)可知：不同濃度的Cmp處理都會顯著提高萊茵衣藻中葉綠素a的含量，但當(dāng)質(zhì)量濃度為20μg/mL時，葉綠素含量低于5μg/mL的處理組，但略高于對照組。由圖2(c)可知：各濃度的處理，萊茵衣藻的葉綠素a含量都顯著低于對照組，4 d后，葉綠素a的含量開始下降。由圖2(d)可知：各濃度的處理使萊茵衣藻的葉綠素a含量都顯著低于對照組，1 d后，葉綠素a的含量開始下降。
葉綠素a的含量是用來表征藻細(xì)胞生物量變化的另一重要參數(shù)。前期研究發(fā)現(xiàn)，小球藻(C.vtdgarisBeij.)、金藻8701(IsochrysisgalbanaParke 8701)和小新月菱形藻(NitzschiadosteriumHer.)葉綠素a含量受到氯霉素、遺傳霉索、青霉素3種抗生素的影響，其中0～200μg/mL遺傳霉素明顯抑制3種微藻葉綠素a的含量，質(zhì)量濃度低于100μg/mL氯霉素對小球藻和金藻葉綠素a含量的影響較小，但當(dāng)質(zhì)量濃度大于50μg/mL時，會使小新月菱形藻葉綠素a的含量顯著下降；3種藻對青霉素的敏感性存在差異，當(dāng)質(zhì)量濃度低于100μg/mL時能夠促進(jìn)3種藻葉綠素a的含量，而相對增長率卻隨著青霉素濃度的升高而逐漸下降。在本研究中，4種抗生素處理后，葉綠素a含量的變化與藻細(xì)胞密度的變化趨勢基本上是一致的，即低濃度的Amp(50和100μg/mL)處理及Cmp各濃度的處理，促使藻細(xì)胞葉綠素a的含量增加，而Kan及Tet各濃度的處理都會顯著減少萊茵衣藻的葉綠素a的含量。低濃度的青霉素處理使藻細(xì)胞葉綠素a的含量上升，可能是因為一方面促進(jìn)細(xì)胞內(nèi)核酸和蛋白質(zhì)的合成，另一方面降低細(xì)胞中葉綠素酶的活性來延緩葉綠素的降解，從而提高葉綠素a的含量；而高濃度抗生素的處理會使藻細(xì)胞葉綠素a的含量下降，原因可能是：①抗生素的脅迫可以引起葉綠體膨脹破裂，類囊體膜解體，從而導(dǎo)致葉綠體從組織中流失，抗生素處理的會導(dǎo)致藻體細(xì)胞的rETR值下降，也暗示了光合囊體膜遭到了破壞；②細(xì)胞內(nèi)活性氧的積累導(dǎo)致葉綠體結(jié)構(gòu)破壞，葉綠素合成受阻；③抗生素直接與藻體的某些成分結(jié)合，抑制葉綠體片層中捕光色素-蛋白復(fù)合體的合成，導(dǎo)致轉(zhuǎn)能效率降低。
2.3抗生素對萊茵衣藻光化學(xué)活性的影響
2.3.1不同抗生素對萊茵衣藻YII的影響
圖3顯示了在4種抗生素各濃度的處理下，萊茵衣藻的YII在7 d內(nèi)的變化情況。圖3(a)顯示：50μg/mL的Amp處理使萊茵衣藻的YII值在7 d內(nèi)均高于未處理組；當(dāng)質(zhì)量濃度為100μg/mL時，處理后第1天的YII值略高于未處理組，但從第2天開始下降，到第4天明顯低于未處理組；當(dāng)質(zhì)量濃度為120μg/mL及140μg/mL時，均使萊茵衣藻的YII值在處理后就顯著低于未處理組，處理濃度越高，YII值下降越快，其中當(dāng)質(zhì)量濃度為140μg/mL時，萊茵衣藻的YII值在7 d后下降為0.36，而未處理組的YII值為0.53。圖3(b)顯示：5μg/mL的Cmp處理沒有顯著影響萊茵衣藻的YII值，當(dāng)質(zhì)量濃度為10μg/mL時，萊茵衣藻在生長7 d內(nèi)的YII值略高于未處理組；質(zhì)量濃度為15μg/mL及20μg/mL的處理均使萊茵衣藻的YII值在處理后顯著低于未處理組，處理濃度越高，YII值下降得越快，其中當(dāng)質(zhì)量濃度為20μg/mL時，萊茵衣藻的YII值在7 d后下降為0.30，而未處理組的YII值為0.53。圖3(c)及圖3(d)顯示：各濃度的處理均使萊茵衣藻的YII值在處理后就顯著低于未處理組，并且處理濃度越高，YII值下降得越快，其中質(zhì)量濃度40μg/mL的Kan及20μg/mL的Tet在處理后的第1天就使萊茵衣藻的YII值從未處理時的0.47下降到0.001。
圖3不同濃度的Amp(a)、Cmp(b)、Kan(c)及Tet(d)處理對萊茵衣藻YII的影響
圖4不同濃度的Amp(a)、Cmp(b)、Kan(c)及Tet(d)處理對萊茵衣藻rETR的影響
2.3.2不同抗生素對萊茵衣藻rETR值的影響
圖4顯示了在4種抗生素各濃度的處理下，萊茵衣藻的rETR值在7 d內(nèi)的變化情況。圖4(a)顯示了質(zhì)量濃度為50及100μg/mL的Amp處理使萊茵衣藻的rETR值均高于未處理組，且50μg/mL處理的rETR值高于100μg/mL處理的rETR；當(dāng)Amp質(zhì)量濃度為120及140μg/mL時，從處理后第2天開始，rERT值顯著低于未處理組。圖4(b)顯示：Cmp處理時，除20μg/mL質(zhì)量濃度外，其他3個處理濃度的rETR值均高于未處理組，且5μg/mL處理的rETR值大于10μg/mL處理的rETR值，10μg/mL處理的rETR值大于15μg/mL處理的rETR值。圖4(c)顯示：Kan各濃度處理的rETR值均小于未處理組，且處理的濃度越高，rETR值下降得越低。圖4(d)顯示：Tet的處理在質(zhì)量濃度為5μg/mL時，第1天的值升高，隨后下降，到第3天時與未處理組相同，隨后下降顯著低于未處理組，其他3個處理濃度均低于未處理組。
葉綠素?zé)晒獾淖兓軌蛘鎸嵉胤从彻饽芪铡⒓ぐl(fā)光能傳遞和光化學(xué)反應(yīng)等光合作用的原初反應(yīng)過程。YII及rETR分別指光系統(tǒng)II的實際光能轉(zhuǎn)換效率或?qū)嶋H光量子產(chǎn)額及經(jīng)過光系統(tǒng)II的相對線性電子流。在本研究中，萊茵衣藻的YII及rETR對抗生素的處理非常敏感。YII的值在低質(zhì)量濃度的Amp(50μg/mL)及Cmp(10μg/mL)處理的前期(3 d前)升高，可能與藻液中抑生菌的去除有關(guān)，但在3 d后，YII的值有所下降，說明低濃度的Amp及Cmp的處理會對YII有輕微的抑制作用；對于Kan及Tet的處理，在加入抗生素后YII就急劇下降，說明Kan及Tet的處理會嚴(yán)重抑制萊茵衣藻的光反應(yīng)，也有報道證明，鏈霉素會選擇性地給合小球藻的核糖體70S亞基，從而抑制小球藻的PSII的D1、CP43及CP47等蛋白的合成，來降低小球藻的光合效率；rETR值在低質(zhì)量濃度的Amp(50及100μg/mL)及Cmp(5、10及15μg/mL)處理的rETR值都高于未處理組，但隨著處理時間的延長，rETR值逐漸降低；Kan及Tet的處理都會使rETR的值急劇下降；rETR值隨著抗生素的加入下降，rETR值的大小反映了PSII反應(yīng)中心在光下的開放程度，它的降低暗示了光反應(yīng)中心的關(guān)閉，可能是由于抗生素的存在阻礙了光合電子傳遞過程中的由電子傳遞體QA到QB的電子傳遞過程，也可能是抗生素作用于電子傳遞鏈上的蛋白酶，抑制酶的活性，進(jìn)而影響電子傳遞，從而影響光合作用效率。本研究結(jié)果可以看出，4種抗生素的處理對YII與rETR值的影響具有很強(qiáng)的相關(guān)性，但影響的程度有些不同，光合效率降低的部分原因是由于電子傳遞效率的下降，除此之外可能還包括熱能散失及非光化學(xué)淬滅等因素。關(guān)于抗生素對光化學(xué)活性的影響機(jī)制，目前仍然沒有確切的解釋，其機(jī)制有待進(jìn)一步揭示。
2.4抗生素對萊茵衣藻伴生細(xì)菌的抑制作用
將抗生素處理7 d后和對照組的藻液用無菌TAP培養(yǎng)液稀釋100倍，分別涂布在LB培養(yǎng)基上，菌落生長情況如圖5所示，結(jié)合圖5細(xì)菌數(shù)量的統(tǒng)計結(jié)果，表明在筆者所選取的濃度內(nèi)，隨著4種抗生素濃度的增加，細(xì)菌的數(shù)量隨之減少，濃度越高效果越明顯。當(dāng)藻液中Cmp的終質(zhì)量濃度達(dá)到20μg/mL時，可以完全抑制藻液中細(xì)菌的生長。在20μg/mL質(zhì)量濃度下，雖然Tet對藻液中細(xì)菌的抑制作用也很明顯，但由于Tet質(zhì)量濃度為5μg/mL時，就已經(jīng)表現(xiàn)出對萊茵衣藻的生長具有顯著抑制作用(P<0.05)；藻液中Kan的終質(zhì)量濃度達(dá)到60μg/mL時，即使可以完全抑制細(xì)菌的生長，但其質(zhì)量濃度為10μg/mL時，對萊茵衣藻的抑制作用已達(dá)到顯著(P<0.05)；另外，當(dāng)藻液中Amp的終質(zhì)量濃度140μg/mL時，并沒有完全抑制藻液中細(xì)菌的生長，仍可以觀察到有少數(shù)細(xì)菌菌落長出。因此，Amp、Tet及Kan不適合應(yīng)用于萊茵衣藻的無菌化中。
圖5 4種抗生素各處理濃度的藻液中的細(xì)菌檢驗結(jié)果
3結(jié)論
4種抗生素Amp、Cmp、Kan及Tet的不同濃度對萊茵衣藻的細(xì)胞密度、葉綠素a含量及光化學(xué)活性都產(chǎn)生顯著的影響。Amp(低于100μg/mL)及Cmp(低于20μg/mL)，對萊茵衣藻的生長有顯著的促進(jìn)作用，而Kan及Tet的各處理濃度都會顯著抑制萊茵衣藻的生長；萊茵衣藻的光化學(xué)活性對4種抗生素的處理比較敏感，雖然在處理的3 d內(nèi)，Amp(低于50μg/mL)及Cmp(低于10μg/mL)由于“毒物效應(yīng)”會增加萊茵衣藻的YII及rETR值，但處理后期是呈現(xiàn)下降趨勢的，因此4種抗生素的長期存在都會使萊茵衣藻的PSII反應(yīng)中心受損，光合電子傳遞過程受阻及光合效率降低。此外，低濃度的Cmp可用于萊茵衣藻細(xì)胞無菌化培養(yǎng)中，而Amp、Kan及Tet則不適合用于萊茵衣藻的無菌化培養(yǎng)。本研究結(jié)果表明，水生環(huán)境中抗生素的存在，會顯著影響萊茵衣藻的生長及光化學(xué)活性，尤其是不斷累積的抗生素也會對萊茵衣藻等微藻的生態(tài)平衡產(chǎn)生影響。
相關(guān)新聞推薦
1、雞白痢沙門菌噬菌體PC79-13生長曲線、生物學(xué)特性、基因特征及快速檢測法（六）