2.5.2檢測限測定
根據(jù)熒光顯微鏡鏡下觀察結(jié)果顯示，在細(xì)菌濃度為10 CFU/mL時，在隨機(jī)10個暗視野中仍可檢測到1個及以上的熒光噬菌體結(jié)合目標(biāo)細(xì)菌后形成的熒光棒狀物(圖11)。取三組相同細(xì)菌濃度進(jìn)行再次標(biāo)記檢測驗證，顯示在10個隨機(jī)視野中重復(fù)三次皆能看到熒光棒狀物，檢出率大于95%。因此，熒光標(biāo)記的噬菌體PC79-13可視化檢測其宿主菌雞白痢沙門菌C79-13的檢測限為10 CFU/mL。
圖11 FITC-噬菌體侵染稀釋至10 CFU/mL宿主菌液后熒光顯微觀察(1 000×)
3討論
本研究從污水中分離出一株宿主特異性極強(qiáng)的烈性沙門菌噬菌體PC79-13，電鏡觀察顯示其頭部為二十面體，直徑約為60 nm，屬于有尾噬菌體，在雙層瓊脂平板可形成透明、邊緣清晰的噬菌斑。根據(jù)生物學(xué)特性試驗顯示，該噬菌體宿主譜比同類型的汪祥燕等分離報道的雞白痢沙門菌噬菌體窄，但也顯示其極強(qiáng)的宿主特異性，為后續(xù)檢測和實際應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。同時，噬菌體PC79-13的最佳MOI為0.01，相較于廖彬如等研究的沙門菌噬菌體有更低MOI，表明噬菌體PC79-13需要更少噬菌體原料即可擴(kuò)增出更多噬菌體，產(chǎn)能效率高。根據(jù)一步生長曲線顯示其潛伏期為30 min，在80 min到達(dá)爆發(fā)期，平均裂解量為186 PFU/cell，遠(yuǎn)高于岑鑫等分離的烈性沙門菌，能高效、迅速地裂解宿主菌。另外，面對強(qiáng)酸強(qiáng)堿、紫外照射等惡劣環(huán)境，噬菌體PC79-13展現(xiàn)出良好的耐受力，在距紫外線30 cm處照射45 min后仍有活性，在pH為2.0~12.0時均有活性，酸堿耐受范圍大于高瑤等分離報道出的腸炎沙門菌噬菌體，顯示噬菌體PC79-13在惡劣生存和保藏環(huán)境仍能保持活性相對穩(wěn)定。
根據(jù)對噬菌體PC79-13基因組進(jìn)化分析可知其為長尾噬菌體科、肌尾噬菌體屬的一株噬菌體，基因組總長度為86 886 bp，無明顯的GC偏向性，在基因組水平上無毒力因子，臨床應(yīng)用無潛在風(fēng)險。噬菌體PC79-13共預(yù)測了59個CDS，其中有23個CDS編碼功能蛋白:包括1個參與表達(dá)噬菌體裂解酶的CDS，4個參與編碼噬菌體結(jié)構(gòu)、組裝的CDS(如噬菌體尾絲蛋白、尾部卷尺蛋白、基板組裝蛋白等)，16個參與編碼噬菌體基因組復(fù)制、轉(zhuǎn)錄、蛋白質(zhì)代謝的CDS(包括噬菌體相關(guān)DNA連接酶、DNA引物酶/解旋酶)，2個編碼其他功能蛋白的CDS。噬菌體PC79-13基因組中還含有4個編碼Ia類核糖核苷酸還原酶的CDS，有研究表明Ia類核糖核苷酸還原酶是基因復(fù)制、變異和修復(fù)的關(guān)鍵酶和限速酶。此外，基因組中還含有20個編碼tRNA的CDS。
對于生物檢測而言，基于生物識別和電化學(xué)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)相結(jié)合的平臺，如生物電化學(xué)平臺及實時熒光定量PCR等技術(shù)已被開發(fā)應(yīng)用于病原體檢測。相較于依賴相關(guān)儀器設(shè)備、檢測周期長的檢測方法，本研究探討了FITC標(biāo)記噬菌體制成生物探針以快速可視化檢測宿主沙門菌的可能性。實驗結(jié)果表明:FITC標(biāo)記的噬菌體PC79-13探針仍然保持其侵染宿主菌的活性。PC79-13熒光探針與宿主菌混合15 min后，在熒光顯微鏡下可視化檢測宿主沙門菌，檢測限可達(dá)到10 CFU/mL，相較于目前研發(fā)的其他生物傳感方法具有檢測靈敏度更高、操作簡易和時間短等優(yōu)點，有潛力用于檢測沙門菌臨床樣本。
4結(jié)論
本實驗使用雙層瓊脂平板法分離篩選到一株宿主特異性強(qiáng)的沙門菌噬菌體PC79-13，對強(qiáng)酸、強(qiáng)堿環(huán)境耐受性強(qiáng)，對高溫有一定耐受力，難以經(jīng)紫外線照射滅活;最佳MOI為0.01，在第30 min后出現(xiàn)爆發(fā)式增長，直至80 min左右增殖速率減慢并逐漸趨于穩(wěn)定，平均裂解量為186 PFU/cell;基因組全長86 886 bp，共預(yù)測了59個CDS。噬菌體PC79-13經(jīng)FITC標(biāo)記的熒光噬菌體探針檢測宿主沙門菌，檢測限達(dá)到10 CFU/mL，檢測時間少于20 min，用于動物產(chǎn)品的檢疫檢驗有很好的應(yīng)用前景。
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