產(chǎn)氣莢膜梭菌(Clostridiumperfringens)又稱魏氏梭菌，兼性厭氧，為可產(chǎn)生芽孢的革蘭陽性大桿菌，廣泛分布于自然界中，是一種重要的人獸共患的條件致病菌；根據(jù)其產(chǎn)生的致死性毒素α、β、ε、ι毒素可將其分為A、B、C、D和E共5個(gè)毒素型。其中C型產(chǎn)氣莢膜梭菌主要產(chǎn)生α和β毒素，可以引發(fā)人和禽類的壞死性腸炎、初生小牛和羔羊等反芻動(dòng)物的腸毒血癥、羊猝疽和仔豬紅痢等多種嚴(yán)重疾病，對養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展產(chǎn)生較大的危害。據(jù)報(bào)道，產(chǎn)氣莢膜梭菌可引起牦牛猝死綜合征，主要的臨床特征有牛舌脫垂、肛門外翻，病理剖檢可見肺敗血癥、腸淤血和腸出血等癥狀。本試驗(yàn)通過對牦牛源產(chǎn)氣莢膜梭菌生物特性進(jìn)行研究，為牦牛源產(chǎn)氣莢膜梭菌后續(xù)研究和防治等方面提供一定的參考。
1材料與方法
1.1菌株由西藏農(nóng)牧學(xué)院預(yù)防獸醫(yī)實(shí)驗(yàn)室從青海玉樹地區(qū)牦牛糞樣中分離保存的1株牦牛源產(chǎn)氣莢膜梭菌，命名為qinghai-12。
1.2主要試劑和儀器
梭菌增菌液體培養(yǎng)基、7%羊血瓊脂培養(yǎng)基基礎(chǔ)，均購自青島高科技工業(yè)園海博生物技術(shù)有限公司；無菌脫纖維綿羊血，購自北京索萊寶科技有限公司；細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒，購自天根生化科技(北京)有限公司；最低抑菌濃度(Minimum inhibitory concentration,MIC)試紙，購自意大利Liofilchem公司；Trans 2K DNA Marker、核酸染料GelStain(10 000×)，均購自北京全式金生物技術(shù)有限公司。
PCR儀由Applied Biosystems公司生產(chǎn)；電泳儀、凝膠成像系統(tǒng)，均由美國Bio-Rad生產(chǎn)；高速離心機(jī)由德國Eppendorf生產(chǎn)；恒溫恒濕培養(yǎng)箱由上海博訊實(shí)業(yè)有限公司生產(chǎn)；UV-1800PC型紫外可見分光光度計(jì)由上海美譜達(dá)儀器有限公司生產(chǎn)。
1.3菌株復(fù)蘇培養(yǎng)與觀察
將凍存于-80℃的牦牛源產(chǎn)氣莢膜梭菌緩慢梯度升溫解凍，三區(qū)劃線法接種于無菌血瓊脂平板，41℃恒溫厭氧培養(yǎng)18～24 h。隨后將單菌落接種至梭菌增菌液體培養(yǎng)基中，41℃恒溫厭氧增菌培養(yǎng)16～18 h。革蘭染色后用光學(xué)顯微鏡觀察。
1.4生化鑒定
根據(jù)《伯杰細(xì)菌鑒定手冊》，利用8種(葡萄糖、蔗糖、麥芽糖、吲哚、乳糖、脂酶、卵磷脂酶、酪蛋白)細(xì)菌微量生化管鑒定產(chǎn)氣莢膜梭菌的基本生化特性。根據(jù)陸承平推薦方法，取對數(shù)生長期的梭菌增菌液體培養(yǎng)基1 mL接種于適量無菌石蕊牛奶液體培養(yǎng)基，在45～47℃水浴2 h后，每隔1 h觀察有無“洶涌發(fā)酵”現(xiàn)象，此特性為鑒定產(chǎn)氣莢膜梭菌最為突出的生化特性。
1.5 PCR鑒定
1.5.1 16S rRNA PCR擴(kuò)增按照細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒說明書提取牦牛源產(chǎn)氣莢膜梭菌全基因組DNA，-20℃冷凍保存?zhèn)溆谩：铣杉?xì)菌通用16S rRNA引物，F(xiàn)：5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′；R：5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′。16S rRNA PCR反應(yīng)體系(50μL)：上、下游引物各1μL，2×TaqMix酶25μL，模板2μL，去離子水21μL；PCR反應(yīng)程序：94℃預(yù)變性5 min;94℃變性30 s，55℃退火30 s，72℃延伸1 min，共30個(gè)循環(huán)；72℃終延伸10 min，擴(kuò)增條帶大小為1 456 bp。PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定后，委托擎科生物科技有限公司進(jìn)行測序并上傳至NCBI進(jìn)行序列比對。
1.5.2多重PCR分型
合成產(chǎn)氣莢膜梭菌分型引物(表1)。多重分型PCR體系(50μL)：上、下游引物(共4對)各1μL，2×TaqMix酶25μL，模板2μL，去離子水15μL；PCR反應(yīng)程序：94℃預(yù)變性5 min；94℃變性30 s，53℃退火30 s，72℃延伸30 s，共30個(gè)循環(huán)；72℃終延伸5 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)1%的瓊脂糖凝膠電泳鑒定。
表1 PCR引物信息
1.6生長曲線測定
振蕩比濁法(Dλ法)，將1.3中制備好的增菌液按體積分?jǐn)?shù)1%接種于300 mL梭菌增菌液體培養(yǎng)基，振蕩混勻后均分至15支試管作為試驗(yàn)組，同時(shí)分裝15支無菌梭菌增菌液試管作為空白對照組，石蠟液封，置于41℃恒溫培養(yǎng)箱中持續(xù)培養(yǎng)。每隔2 h取出1支試驗(yàn)組試管和1支空白對照組試管，以空白對照組進(jìn)行調(diào)零，利用UV-1800PC型紫外可見分光光度計(jì)測定培養(yǎng)液OD600 nm值，每個(gè)時(shí)間點(diǎn)重復(fù)測量3次，取平均值，連續(xù)測量24 h。以O(shè)D600 nm值為縱坐標(biāo)、培養(yǎng)時(shí)間為橫坐標(biāo)，利用Microsoft Excel 2019軟件繪制出牦牛源產(chǎn)氣莢膜梭菌的生長曲線。
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