摘要：目前微生物生長量的測定有多種方法。根據(jù)微生物的種類、形態(tài)特征、代謝特性等的差異可以選擇不同的測定方法。以細(xì)菌、真菌、放線菌為主體，從微生物數(shù)量、微生物重量、群體生理指標(biāo)三個方向出發(fā)，通過對三種類別微生物生長量測定常用方法的比較研究，總結(jié)各方法的優(yōu)劣以及使用條件，為之后實驗室里能夠更加準(zhǔn)確地依靠生長量測定某種特定微生物的生長曲線提供指導(dǎo)。
微生物生長曲線通常是指以微生物生長量為縱坐標(biāo)，培養(yǎng)時間為橫坐標(biāo)所繪制的曲線。其是描述微生物生長狀況的基本指標(biāo)。一條典型的生長曲線可以分為延緩期、對數(shù)生長期、穩(wěn)定期和衰亡期四個生長時期[1]。處于對數(shù)生長期時，微生物生命力旺盛，世代時最短而穩(wěn)定，細(xì)胞數(shù)量成倍地增加。所以對數(shù)期常用于發(fā)酵與微生物培養(yǎng)。處于穩(wěn)定期時，微生物代謝產(chǎn)物大量產(chǎn)出并累積。生產(chǎn)應(yīng)用中，可以通過延長穩(wěn)定期來獲得更多所需要的代謝產(chǎn)物。微生物生長量測定的準(zhǔn)確度直接決定了其生長曲線測定結(jié)果的準(zhǔn)確度，而準(zhǔn)確地測定微生物生長曲線對于生產(chǎn)實踐有著重大的指導(dǎo)意義。
目前微生物生長量的測定大致可以分為三類：微生物數(shù)量的測定，微生物重量的測定和群體生理指標(biāo)的測定。測定微生物數(shù)量的方法包括顯微鏡直接計數(shù)法、稀釋平板計數(shù)法、稀釋培養(yǎng)計數(shù)法（最大概率法）、比濁法。測定微生物重量的方法主要指稱重法。群體生理指標(biāo)法指通過測定微生物群體所消耗的營養(yǎng)物質(zhì)或者代謝產(chǎn)物來確定其微生物生長量，例如底物葡萄糖法、含氮量測定法、生物活性測定法等。在實驗與實踐生產(chǎn)中如何在眾多方法中正確選擇一種可以更加準(zhǔn)確、簡便地測定特定微生物的生長量是至關(guān)重要的。
1、微生物數(shù)量測定方法
1.1顯微鏡直接計數(shù)法
顯微鏡直接計數(shù)法是將適量待測微生物樣品懸濁液置于一種特制的有固定面積和體積的計數(shù)板上，在顯微鏡下直接對微生物進(jìn)行計數(shù)的快捷簡便的方法。
目前實驗室內(nèi)主要有兩類計數(shù)板，一般細(xì)菌可采用細(xì)菌計數(shù)板，菌體較大的酵母菌或霉菌孢子可采用血球計數(shù)板。兩類計數(shù)板的原理、使用方法相同，只是較薄的細(xì)菌計數(shù)板使用油鏡觀察更佳[2]。在具體的實驗過程中微生物懸濁液需要用無菌水稀釋至適當(dāng)濃度，以讓每小格的菌數(shù)達(dá)到可以進(jìn)行計數(shù)的范圍內(nèi)。依據(jù)每小格中微生物的數(shù)量換算成每毫升或每克菌液樣品中的微生物數(shù)量，即生長量。該方法主要的缺陷是測得的是菌體總數(shù)，不能區(qū)分活死菌。針對這一缺陷，張霞等對微生物顯微鏡直接計數(shù)法進(jìn)行點滴改進(jìn)研究出了一種美蘭水浸片法，通過使用0.1%美蘭染液對酵母菌進(jìn)行染色將死、活細(xì)胞區(qū)別開來從而降低計數(shù)的誤差[3]。
1.2稀釋平板菌落計數(shù)法
平板菌落計數(shù)法是以適當(dāng)倍數(shù)稀釋所測樣品液至其中微生物分散成單個細(xì)胞，然后通過在適宜生長條件下固體培養(yǎng)基上形成單個菌落的數(shù)目來測定微生物數(shù)量的方法。在實際操作中，首先需要將樣品液經(jīng)過梯度稀釋后取一定量均勻涂布在固體培養(yǎng)基上給予合適的生長條件倒置培養(yǎng)固定時間，最后對平皿上的菌落進(jìn)行計數(shù)。此方法最重要的步驟是稀釋，選取合適的稀釋倍數(shù)可以減小誤差提高測定的準(zhǔn)確度。一般而言，在稀釋過后，每個平皿中細(xì)菌、放線菌、酵母菌的菌落數(shù)在30～300個范圍內(nèi)，霉菌的菌落數(shù)在10～100個范圍內(nèi)。李華通過試驗發(fā)現(xiàn)氧化還原染料TTC或章納氏綠可使細(xì)菌與培養(yǎng)基間顏色對比鮮明，并有輕微的抑菌現(xiàn)象，使得各菌落的邊緣明顯，很少出現(xiàn)菌落交叉的現(xiàn)象，更適宜于觀察計數(shù)[4]。由于該方法針對活菌計數(shù)準(zhǔn)確度高這一特點，通常使用其它方法測定生長曲線時以該方法作為對照標(biāo)準(zhǔn)。
1.3稀釋培養(yǎng)計數(shù)法
稀釋培養(yǎng)計數(shù)法也稱為最大概率法，其原理為數(shù)學(xué)概率統(tǒng)計法。首先需要對菌液進(jìn)行十倍系列梯度稀釋，直到稀釋液接種到培養(yǎng)基上不出現(xiàn)或極少出現(xiàn)細(xì)菌生長，以出現(xiàn)生長的最低稀釋度與沒有出現(xiàn)生長的最高稀釋度為基礎(chǔ)，憑借“或然率”理論計算單位體積樣品中近似菌數(shù)。一般每個稀釋度的重復(fù)接種管數(shù)為3管，接種后需繼續(xù)培養(yǎng)一定時段，之后確定三位數(shù)字的數(shù)量指標(biāo)（原則為：最高稀釋度中重復(fù)試管全部長菌的管數(shù)作為數(shù)量指標(biāo)的第一個數(shù)字；再取后面兩個稀釋度中長菌的管數(shù)，作為余下的兩個數(shù)字）。根據(jù)數(shù)量指標(biāo)可從最大可能數(shù)表中查到最大可能細(xì)菌數(shù)從而確定生長量。
1.4比濁法
比濁法測定生長量的原理是以細(xì)菌懸浮液的生物量與懸浮液的混濁程度成正比為基礎(chǔ)，利用紫外可見分光光度計測定的OD600值間接推斷樣品中微生物總量。實驗過程大致為：（1）細(xì)菌樣品的接種培養(yǎng)：接同樣量的菌種子液于2-3瓶液體培養(yǎng)基中，并設(shè)置一空白樣。之后將空白樣和樣品一同放置搖培箱進(jìn)行培養(yǎng)。（2）測定OD值：設(shè)置儀器波長為600nm，以CK作為對照測定樣品不同培養(yǎng)時間的菌液OD600值，若菌懸液濃度過大，需稀釋適當(dāng)倍數(shù)，使OD值在0.1～0.8，并記錄培養(yǎng)時間、稀釋倍數(shù)和OD600值[5]。朱艷蕾在對細(xì)菌生長曲線測定實驗方法的研究表明，產(chǎn)紅色素菌株AY9因為紅色代謝物的積累導(dǎo)致生長曲線不但沒有出現(xiàn)衰亡期，反而出現(xiàn)穩(wěn)定期后又有增長趨勢[6]，這說明代謝物顏色過深會嚴(yán)重影響吸光度。雖然比濁法省時省力，但是其原理并不適用于所有細(xì)菌，謝三磊等在對副雞禽桿菌A、B、C三個血清型參考菌株的研究中發(fā)現(xiàn)在對數(shù)生長期和穩(wěn)定期，菌液OD600值和活菌數(shù)之間并非線性關(guān)系，而是比較復(fù)雜的一元二次多項式回歸關(guān)系[7]。
1.5幾種數(shù)量測定方法的比較
2、微生物重量測定方法
微生物重量測定方法使用稱重法。稱重法是直接將菌體經(jīng)過一定的處理后稱取干重，以重量的變化來反映微生物生長量大小的方法。該方法普遍適用于放線菌與真菌，由于這兩種菌屬個體、形態(tài)、生長周期等特點與細(xì)菌相差較大，所以常用的細(xì)菌生長量測定方法不適用于這兩者。大體步驟為：每個相應(yīng)時間點分別設(shè)2～3個平行，在對應(yīng)時間點取出菌液進(jìn)行離心后將菌絲體洗滌干凈（洗滌次數(shù)可為1～2次），之后再次離心、105℃烘干沉淀物至兩次重量無差別，最后計算出平行試驗的平均數(shù)即可。稱重法原理簡單但是操作復(fù)雜、干燥時間長、過程中造成的誤差較大并且在實際生長曲線測定中很難確定樣品何時進(jìn)入衰亡期。
3、群體生理指標(biāo)測定方法
3.1含氮量測定法
氮是蛋白質(zhì)中穩(wěn)定的主要成分，且微生物細(xì)胞中蛋白質(zhì)含量很穩(wěn)定。利用凱氏定氮法理論基礎(chǔ)：蛋白質(zhì)中的含氮量通常占其總質(zhì)量的16%左右，而微生物中蛋白質(zhì)含量又平均占細(xì)胞總質(zhì)量的68%左右。在測得菌體含氮量后再算得蛋白質(zhì)的總量之后進(jìn)一步確定樣品細(xì)胞的總質(zhì)量即可確定其生長量[9]。大致步驟為：在有加速劑的條件下，用濃硫酸消化樣品經(jīng)過高溫分解反應(yīng)將有機氮都轉(zhuǎn)變成銨鹽，堿化后隨水蒸氣蒸餾出來的氨被過量的硼酸吸收，再以標(biāo)準(zhǔn)酸溶液滴定，就可計算出樣品中的全氮含量，以全氮含量間接反映生長量的大小。當(dāng)然，其它氮素測定法也可根據(jù)具體情況選擇性使用。
3.2底物消耗法
碳源是微生物生長過程中必不可少的營養(yǎng)物質(zhì)，以葡萄糖為例，我們可以根據(jù)樣品微生物消耗的葡萄糖量來確定其生長狀況。采用DNS法測定培養(yǎng)液中殘留的葡萄糖含量，首先使用葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液配制工作曲線樣液，在540nm波長下測定吸光度，得到工作曲線方程。將離心后的樣品上清液進(jìn)行稀釋相應(yīng)倍數(shù)，取部分于試管中，加入DNS試劑后用蒸餾水定容，測定其吸光度后求得上清液中葡萄糖含量。李鴻梅等在對羅耳阿太菌的生長曲線的測定研究中發(fā)現(xiàn)底物消耗法與稱重法所測得的羅耳阿太菌的生長曲線都可以準(zhǔn)確地顯示出延緩期、對數(shù)期、穩(wěn)定期的時間點，且相比之下，底物葡萄糖消耗法操作更加簡單、數(shù)值更準(zhǔn)確、更適合大型工業(yè)生產(chǎn)[10]。除了葡萄糖外，微生物生長過程中還需很多消耗物，實驗者還可根據(jù)不同微生物特點從五大營養(yǎng)物質(zhì)碳源、氮源、礦質(zhì)元素、水、生長因子著手。
3.3生物活性法
目前世界上半數(shù)以上的抗生素都是放線菌產(chǎn)生的。所以依據(jù)其代謝物的抑菌效果，可以通過投放放線菌的目標(biāo)作用菌于固體培養(yǎng)基中，在固定的時間測定抑菌圈的直徑大小間接反映放線菌的生長量的大小。張紅丹等在放線菌769生長曲線的測定中，發(fā)現(xiàn)用測抑菌圈直徑法、比濁法、稱取菌絲體干重法測定的放線菌769生長曲線和生物活性，變化趨勢基本一致，證明了抑菌圈直徑法的有效性[11]。該方法的適用條件較為局限，試驗前需要知道樣品菌種對哪種微生物的生長有抑制作用。
4、結(jié)語
基于微生物生長曲線下生長量的測定對于實驗室微生物的深入研究與工業(yè)生產(chǎn)實踐具有重要作用。測定微生物生長量并不局限于本文所列出的方法，但是從使用率與準(zhǔn)確率來看，上述方法都是很實用的。單細(xì)胞細(xì)菌多使用數(shù)量測定法，在細(xì)菌不帶深色且代謝產(chǎn)物影響較小的情況下又多使用比濁法。一般在使用除平板菌落計數(shù)法外的另外三種數(shù)量測定法所得結(jié)果都需要與平板菌落計數(shù)法的結(jié)果進(jìn)行相關(guān)性分析來提高生長曲線的準(zhǔn)確度。放線菌與真菌不常使用數(shù)量測定法（如放線菌菌絲較少較小也可以用OD法，不過誤差比較大），測定多以重量測定法為主，以群體生理指標(biāo)測定為輔。不管怎樣，要根據(jù)實際情況與微生物的特征選擇最合適的生長量測定方法來確定生長曲線。
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基金：揚州大學(xué)本科專業(yè)品牌化建設(shè)與提升工程項目(ZYPP2018C017);揚州大學(xué)2019年大學(xué)生學(xué)術(shù)科技創(chuàng)新基金項目.
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