隨著水貂養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展,養(yǎng)殖規(guī)模也在不斷擴大,水貂經過多年的人工馴化,長期處于不良飼養(yǎng)環(huán)境下,導致其抗病能力出現大幅度降低,一旦發(fā)病就會造成巨大的經濟損失,這也是制約水貂養(yǎng)殖業(yè)發(fā)展的重要因素。綠膿桿菌又稱為銅綠假單胞菌,廣泛存在于自然界中,能夠引起水貂出血性肺炎,嚴重危害水貂養(yǎng)殖業(yè)。綠膿桿菌普遍存在較強耐藥性,據報道其對第三代頭孢菌素等的耐藥率高達60%,急需開發(fā)新的抗生素替代品,用于綠膿桿菌病的防治。
噬菌體是一種能夠特異性侵染細菌的病毒,在自然界中廣泛存在,影響著細菌的生態(tài)及進化。根據噬菌體侵入和裂解細菌的特點,可將噬菌體分為溶源性噬菌體和烈性噬菌體。烈性噬菌體通過識別宿主菌細胞表面受體吸附于細菌表面,進而快速裂解細菌,具有種屬特異性強、不影響正常菌群、不受細菌耐藥性影響的優(yōu)點,具有作為抗生素替代品的潛在開發(fā)優(yōu)勢。近年來,烈性噬菌體廣泛應用于食品消毒和細菌病的預防和治療。
本試驗用雙層平板法分離得到了1株綠膿桿菌噬菌體,測定了該噬菌體的形態(tài)和生物學特性,為進一步開發(fā)噬菌體制劑防治水貂綠膿桿菌病提供依據。
1材料與方法
1.1材料27株綠膿桿菌臨床分離株由青島農業(yè)大學微生物實驗室保存。水貂糞便樣本采集自青島市膠州水貂養(yǎng)殖場。
1.2方法
1.2.1噬菌體的分離與純化
水貂糞樣加入500 mL LB肉湯和27株綠膿桿菌新鮮菌液各500μL混勻,37℃過夜培養(yǎng),增殖噬菌體。樣品經過濾、離心、抽濾后,各取100μL濾液分別加入等量27株綠膿桿菌菌液,雙層平板法分離噬菌體。用單斑法純化分離到的噬菌體。
1.2.2噬菌體的電鏡觀察參
取噬菌體增殖液滴于銅網上,2%磷鎢酸(PTA)染色,干燥后,透射電子顯微鏡觀察噬菌體形態(tài)。
1.2.3噬菌體裂解譜的測定
根據點樣法測定噬菌體的裂解譜。分別將27株綠膿桿菌增殖液200μL均勻涂布于普通培養(yǎng)基平板,滴加噬菌體增殖液于平板,于37℃恒溫培養(yǎng)箱中倒置培養(yǎng)6 h。
1.2.4噬菌體效價測定
將噬菌體增殖液10倍比稀釋后,取100μL各稀釋度的增殖液分別與等量的菌液混勻,用雙層平板法進行噬菌體效價的測定。
1.2.5噬菌體對溫度、pH值敏感性的測定
噬菌體增殖液分別加入不同pH值(2～13)的LB肉湯,37℃水浴分別作用1、2 h和3 h,立即測定噬菌體效價,繪制噬菌體phage30的pH值穩(wěn)定性曲線。100μL的噬菌體增殖液分別在40℃、50℃、60℃、70℃和80℃水浴中作用20、40 min和60 min,立即測定噬菌體效價,繪制噬菌體phage30的熱穩(wěn)定性曲線。
1.2.6噬菌體最佳感染復數測定
對噬菌體增殖液和對數期的宿主菌菌液進行計數。分別按照感染復數為0.001、0.01、0.1、1、10和100的比例混勻至LB肉湯中,37℃振蕩培養(yǎng)至搖清,雙層平板法測定噬菌體效價。
1.2.7噬菌體一步生長曲線測定
參照Zhang C等報道測定噬菌體一步生長曲線,方法略有改動。按最佳感染復數比例混勻噬菌體增殖液和宿主菌菌液,37℃孵育5 min,13 000 r/min離心30 s,LB肉湯重復洗滌兩次,棄上清。用LB肉湯重懸沉淀,37℃震蕩培養(yǎng)。在不同的時間點取200μL的增殖液,16 000 r/min離心1 min,測噬菌體效價。繪制一步生長曲線。
相關新聞推薦
2、生長曲線分析儀監(jiān)測突變體在抗生素利福平處理后的生長恢復情況（二）
3、微生物的分離培養(yǎng)方法、操作步驟及注意事項——劃線分離法、涂布平板法