為了提高植物乳桿菌Lactobacillus plantarum KLDS1.0386的膽鹽水解酶產(chǎn)量，本實(shí)驗(yàn)通過(guò)響應(yīng)面法對(duì)其發(fā)酵培養(yǎng)基進(jìn)行優(yōu)化。通過(guò)單因素實(shí)驗(yàn)、Plackett-Burman實(shí)驗(yàn)、最陡爬坡實(shí)驗(yàn)和Box-Behnken實(shí)驗(yàn)，最終獲得最優(yōu)培養(yǎng)基為：葡萄糖18.2 g/L、蛋白胨15.03 g/L、酵母粉9.97 g/L、乙酸鈉3.13 g/L、檸檬酸氫二銨2.00 g/L、磷酸氫二鉀2.00 g/L、硫酸錳0.25 g/L、硫酸鎂0.58 g/L。優(yōu)化前植物乳桿菌KLDS1.0386產(chǎn)膽鹽水解酶的比酶活為1.04 U/mg，經(jīng)過(guò)培養(yǎng)基的優(yōu)化后，膽鹽水解酶的比酶活為3.37 U/mg，比優(yōu)化前提高了3.24倍。且實(shí)驗(yàn)結(jié)果與模型預(yù)測(cè)結(jié)果誤差在允許范圍內(nèi)，說(shuō)明該模型可以投入使用。
隨著人們生活水平的提高，高血壓、冠心病等心血管疾病的發(fā)病率逐年上升，醫(yī)學(xué)研究表明，人體內(nèi)膽固醇含量過(guò)高是心血管疾病發(fā)生的重要原因之一。目前，國(guó)內(nèi)外對(duì)于乳酸菌降膽固醇的研究越來(lái)越多，乳酸菌在生長(zhǎng)代謝的過(guò)程中會(huì)產(chǎn)生膽鹽水解酶（bile salt hydrolase，BSH），它是一種胞內(nèi)酶，能將體內(nèi)的結(jié)合膽鹽降解成游離膽酸和氨基酸，游離膽酸能與血清中的膽固醇發(fā)生共沉淀，隨糞便一同排出體外，因此降低了膽固醇水平。所以提高細(xì)菌中膽鹽水解酶的含量，對(duì)降低膽固醇水平具有很重要的意義。國(guó)內(nèi)方面利用響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)優(yōu)化BSH的培養(yǎng)基成分報(bào)道比較少，為了提高膽鹽水解酶活力，本實(shí)驗(yàn)選擇了植物乳桿菌KLDS1.0386，該菌具有很好的益生特性，而且體外降膽固醇能力達(dá)到55.71%，在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上進(jìn)行了Plackett-Burman實(shí)驗(yàn)，篩選出影響B(tài)SH比酶活的3個(gè)顯著性因素，并進(jìn)行最陡爬坡實(shí)驗(yàn)確定出實(shí)驗(yàn)因素的中心點(diǎn)，設(shè)計(jì)Box-Behnken實(shí)驗(yàn)，最終進(jìn)行響應(yīng)面分析，建立培養(yǎng)基成分與膽鹽水解酶比酶活之間的回歸方程模型，以期為以后高產(chǎn)膽鹽水解酶乳酸菌發(fā)酵制品的開(kāi)發(fā)和研制提供依據(jù)。
1材料與方法
1.1材料與儀器
植物乳桿菌KLDS1.0386分離自內(nèi)蒙古傳統(tǒng)發(fā)酵乳制品，由東北農(nóng)業(yè)大學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室工業(yè)微生物菌種保藏中心（KLDS-DICC）提供；茚三酮上?；菔郎噭┯邢薰?；95%乙醇天津市富宇精細(xì)化工有限公司；MRS液體培養(yǎng)基天津基準(zhǔn)化學(xué)試劑有限公司；考馬斯亮藍(lán)，牛血清白蛋白，溶菌酶。
GL-21M型離心機(jī)；VD-1320型潔凈工作臺(tái)；DHP-9272型電熱恒溫培養(yǎng)箱；YH-2S型遠(yuǎn)紅外恒溫干燥箱；微生物曲線分析儀；XK96-A型快速混勻器；DU800型紫外分光光度計(jì)。
1.2實(shí)驗(yàn)方法
1.2.1植物乳桿菌KLDS1.0386的生長(zhǎng)曲線挑取平板上的植物乳桿菌單菌落，接種到MRS液體培養(yǎng)基中，傳代培養(yǎng)2次后，以2%的接種量接種于MRS液體培養(yǎng)基中，于37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。每隔2 h于紫外分光光度計(jì)上測(cè)一次OD620，直到24 h，記錄菌的生長(zhǎng)情況，繪制生長(zhǎng)曲線。
1.2.2BSH比酶活測(cè)定將植物乳桿菌KLDS1.0386傳代培養(yǎng)2次后，接種到MRS液體培養(yǎng)基中，培養(yǎng)至穩(wěn)定初期，離心（10000×g，4℃，10 min）留菌體，用磷酸緩沖液清洗兩次后，加入VC磷酸緩沖液和溶菌酶溶液，37℃水浴30 min后，在冰浴條件下進(jìn)行細(xì)胞超聲破碎（600 W，15 min），離心后留上清，即為粗酶液。
采用茚三酮顯色法來(lái)測(cè)定BSH酶活，取0.1 mL的粗酶液，加入0.1 mL的50 mmol/L?；敲撗跄扄}溶液、0.8 mL的pH6.0的磷酸鈉緩沖液，振蕩混勻后37℃水浴30 min，之后冷卻終止反應(yīng)，加入0.5 mL的三氯乙酸（15%，w/v）沉淀蛋白質(zhì)，3 min后離心（10000×g，4℃，10 min），留上清液，并加入1.5 mL的茚三酮顯色液，混勻后沸水浴15 min，冰浴至室溫，在紫外分光光度計(jì)上測(cè)得在570 nm處的最大吸收值。蛋白質(zhì)濃度的測(cè)定參照文獻(xiàn)，比酶活定義為每毫克蛋白質(zhì)所含的膽汁鹽水解酶的單位（U）數(shù)。
1.2.3單因素實(shí)驗(yàn)
以普通MRS培養(yǎng)基為基礎(chǔ)，分別以可溶性淀粉、果糖、蔗糖、葡萄糖、麥芽糖、乳糖作為碳源，添加量為20 g/L，進(jìn)行比酶活測(cè)定，從而確定最佳碳源。
在最佳碳源的基礎(chǔ)上，將氮源分別替換成蛋白胨、胰蛋白胨、酵母粉、硫酸銨、大豆蛋白胨、牛肉膏，添加量為25 g/L，進(jìn)行比酶活測(cè)定，確定最佳氮源。
在最佳碳源和氮源基礎(chǔ)上，進(jìn)行復(fù)合氮源的優(yōu)化，共設(shè)計(jì)4組實(shí)驗(yàn)，1號(hào)：蛋白胨5 g/L、酵母粉20 g/L，2號(hào)：蛋白胨10 g/L、酵母粉15 g/L，3號(hào)：蛋白胨15 g/L、酵母粉10 g/L，4號(hào)：蛋白胨20 g/L、酵母粉5 g/L，篩選出膽鹽水解酶產(chǎn)量最高的氮源組合。1.2.4Plackett-Burman實(shí)驗(yàn)根據(jù)單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果，葡萄糖、蛋白胨和酵母粉對(duì)膽鹽水解酶產(chǎn)量有很重要的影響，乙酸鈉、磷酸氫二鉀、檸檬酸氫二銨、硫酸錳、硫酸鎂都會(huì)有重要影響，所以此8種成分，被選為Plackett-Burman實(shí)驗(yàn)的影響因素，膽鹽水解酶比酶活作為響應(yīng)值。利用軟件Design Expert進(jìn)行Plackett-Burman實(shí)驗(yàn)的設(shè)計(jì)，每一因素設(shè)置高（+1）、低（-1）兩個(gè)水平，高水平為低水平的1.5倍，總共進(jìn)行12組實(shí)驗(yàn)，進(jìn)而篩選出對(duì)膽鹽水解酶比酶活影響最顯著的因素。
表1 Plackett-Burman實(shí)驗(yàn)因素及水平表
1.2.5最陡爬坡實(shí)驗(yàn)
根據(jù)Plackett-Burman實(shí)驗(yàn)的顯著性結(jié)果，設(shè)計(jì)最陡爬坡實(shí)驗(yàn)，篩選出膽鹽水解酶比酶活最高時(shí)顯著性因素的濃度梯度。
1.2.6Box-Behnken實(shí)驗(yàn)
根據(jù)Plackett-Burman實(shí)驗(yàn)和最陡爬坡實(shí)驗(yàn)的結(jié)果，利用Design Expert軟件進(jìn)行Box-Behnken實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，3個(gè)影響因素，3個(gè)水平，共形成15組實(shí)驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)如表2所示。實(shí)驗(yàn)結(jié)果用Design-Expet軟件進(jìn)行回歸分析，確定優(yōu)化后的最佳培養(yǎng)基。
表2 Box-Behnken實(shí)驗(yàn)因素及水平表
1.3數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)方法
利用SPSS 19分析軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析，離散度通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)差來(lái)表示，結(jié)果數(shù)據(jù)用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差來(lái)表示。
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