砷及其化合物是常見的環(huán)境污染物，地殼中的砷豐度約為1.8 ppm，巖石和土壤中砷的含量從小于1 ppm至幾百ppm，砷在自然界廣泛的存在性導(dǎo)致了砷污染的不可避免。微生物砷氧化有兩點(diǎn)重要意義：一是As(Ⅲ)的毒性大大強(qiáng)于As(Ⅴ)，因此通過氧化反應(yīng)可以降低環(huán)境中的砷污染毒性，同時(shí)三價(jià)砷氧化菌通過砷氧化反應(yīng)過程中產(chǎn)生的能量能夠完成自身的代謝和生長(zhǎng)。從黃石某冶煉廠取得的土樣及水樣中分離出耐受砷菌株，對(duì)單菌落進(jìn)行三價(jià)砷氧化能力鑒定，獲得一株菌株，其能在培養(yǎng)基環(huán)境中將As(Ⅲ)氧化為As(Ⅴ)，且其氧化率接近100%，將其命名為11號(hào)菌株。根據(jù)16S rRNA基因構(gòu)建的進(jìn)化樹結(jié)果分析表明，11號(hào)菌株屬于假單胞菌屬。分析11號(hào)菌株對(duì)As(Ⅲ)和Cu2+濃度的耐受性結(jié)果表明，As(Ⅲ)和Cu2+對(duì)11號(hào)菌株生長(zhǎng)的抑制作用呈濃度正相關(guān)。
砷又稱砒，屬于類金屬，即一種兩性元素，同時(shí)具有金屬性和非金屬性。砷的毒性和某些性質(zhì)與重金屬相似，且在自然環(huán)境中常與各種重金屬離子共存，形成復(fù)合污染，即其來源和危害與重金屬相似，因此，砷常常又被列為重金屬來研究。是一種分布廣泛，有毒并且危害人類健康的化學(xué)元素，皮膚接觸低劑量的砷即可能致癌或致命。過量的砷對(duì)環(huán)境和人體都有嚴(yán)重的危害作用，我國(guó)已經(jīng)將砷及其化合物列為“水中優(yōu)先控制污染物黑名單”。
在2011年國(guó)務(wù)院批文的《重金屬污染防治十二五規(guī)劃》中將砷(As)污染列為工作重點(diǎn)之一，是重點(diǎn)污染物?！吨亟饘傥廴痉乐问逡?guī)劃》指出由于重金屬污染持續(xù)時(shí)間長(zhǎng)，治理技術(shù)落后，監(jiān)督管理薄弱，重金屬的不可降解性使部分地區(qū)的水體底泥，場(chǎng)地和土壤污染物不斷積累，潛在事故風(fēng)險(xiǎn)高，對(duì)群眾健康造成嚴(yán)重威脅。由于砷不能被降解的性質(zhì),將砷轉(zhuǎn)移到安全的地方或者把高毒性的砷轉(zhuǎn)化為低毒性的砷，甚至轉(zhuǎn)化為低水溶性或不溶于水的礦化物質(zhì)成為砷污染治理的方向。
目前的處理方法有離子交換法、共沉淀、反滲透、吸附法和生物法五類處理方法。但是離子交換法費(fèi)用高、共沉淀會(huì)產(chǎn)生砷廢渣、反滲透在實(shí)際應(yīng)用中并不廣泛、而生物法個(gè)體微小，多為單個(gè)個(gè)體或個(gè)體結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單的多細(xì)胞體作為土壤中重要的活性膠體組分，微生物比表面積大，易于繁殖，分布范圍廣，具有積累作用另外，微生物可作為電子傳遞體或受體氧化，還能分泌相關(guān)生物酶來氧化或甲基化As(Ⅲ)，因此，微生物技術(shù)在砷污染治理過程中，也占據(jù)很重要的地位，是最具發(fā)展?jié)摿Φ姆椒ā?
1材料與方法
1.1砷耐受菌株的篩選
本研究從黃石某冶煉廠取得的土樣及水樣篩選砷耐受菌株。配制土壤懸液：稱取5g土樣或10 mL水樣，溶于200mL蒸餾水中，于37℃，180rpm恒溫?fù)u床振蕩30min。取滅完菌含15%瓊脂的TSB(胰蛋白胨大豆)培養(yǎng)基加入經(jīng)細(xì)菌過濾器處理砷酸鈉或亞砷酸鈉(終濃度分別為35mM和55mM)，倒平板，待平板凝固后在每個(gè)平板中均勻涂布100uL樣品稀釋液(將樣品稀釋成10-1，10-2，10-3，10-4，10-5，10-6)放置于28℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，挑單菌落稀釋劃線純化菌種。
1.2菌株砷氧化能力的鑒定
砷離子與銀離子發(fā)生反應(yīng)，As(Ⅲ)產(chǎn)生亞砷酸銀呈淡黃色，As(Ⅴ)產(chǎn)生砷酸銀呈紅棕色，且溶液中兩種價(jià)態(tài)砷含量的不同與銀離子反應(yīng)亦有不同顏色產(chǎn)物。且顏色變化呈梯度變化。因此根據(jù)菌株在含As(Ⅲ)培養(yǎng)基中生長(zhǎng)過后與AgNO3反應(yīng)的顏色與As(Ⅴ)/As(Ⅲ)梯度混合溶液與AgNO3反應(yīng)后產(chǎn)物顏色相對(duì)比即可獲得該菌株大致氧化As(Ⅲ)能力。取砷耐受菌株，置于終濃度0.1 M的含As(Ⅲ)TSB培養(yǎng)基中，于28℃，180rpm恒溫?fù)u床中培養(yǎng)。配置As(Ⅴ)/As(Ⅲ)梯度混合TSB培養(yǎng)基溶液分別為As(Ⅴ)/As(Ⅲ)100/0；90/10；80/20；70/30；60/40；50/50；40/60；30/70；20/80；10/90；0/100置于28℃，180rpm恒溫?fù)u床中培養(yǎng)。培養(yǎng)12h及24h后分別取1mL培養(yǎng)液10000rpm離心5min，取100μL培養(yǎng)液上清加入等體積0.1M AgNO3溶液，觀察并對(duì)比實(shí)驗(yàn)組與As(Ⅴ)/As(Ⅲ)梯度組產(chǎn)物顏色。
1.3 16S rRNA基因測(cè)序鑒定砷氧化菌株
1.3.1制備擴(kuò)增模板將細(xì)菌液體培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，取1mL菌液離心，棄上清；向離心管中加入50L無菌水重懸菌體；將離心管至于沸水中煮沸5～10min，10000rpm離心2min;取2L上清液作為PCR模板。
1.3.2 PCR擴(kuò)增：以砷氧化菌DNA為模板，根據(jù)16SrRNA通用擴(kuò)增引物27F：5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'；1492R：5'-GGTTACCTTGTTACGACTT-3'進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng)。
擴(kuò)增體系(50 L)：
10×PCR buffer(+MgCl2)5.0L
細(xì)菌總DNA 2.0L
27F(10M)1.0L
1492R(10M)1.0L
dNTP(10mM each)1.0L
Taq酶(10U/L)0.25L
ddH2O補(bǔ)至50L
按以下條件擴(kuò)增：94℃預(yù)變性6min，94℃60s，53℃50s，72℃60s共35個(gè)循環(huán)，最后72℃延伸6min。
砷氧化菌株在砷脅迫中生長(zhǎng)曲線測(cè)定及重金屬銅的耐受性（一）
砷氧化菌株在砷脅迫中生長(zhǎng)曲線測(cè)定及重金屬銅的耐受性（二）
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