1.3.3 PCR產(chǎn)物的回收
拿出擴增結束Ep管，從中取出5L反應產(chǎn)物，加入1L上樣緩沖液，再加入4L的ddH2O混勻。點入預先制備好的1%的瓊脂糖凝膠中，120V電泳。在紫外燈下檢測擴增結果。切膠到1.5mL的EP管中，稱重(不超過200mg)，加入600L QG，50℃水浴10min，(如果未完全溶解，要繼續(xù)水浴，直至完全溶解)，每2～3min鐘漩渦混勻一次。將溶液轉到吸附柱上，12000rmp 1min。倒廢液，向吸附柱中加入300 LQG，12000 rmp 1min。倒廢液，加入700LPE，室溫放置2～5min,12000rmp 1min。倒廢液，加入500LPE，室溫放置2-5min,12000rmp 1min。倒廢液，空柱子12000rmp 2min。將吸附柱轉移至無菌EP管中，靜置5min揮發(fā)殘留的PE。向膜中央加入10L的EB，靜置3min，12000rmp 2min，扔掉吸附柱，EP管中即為凝膠回收產(chǎn)物。
1.3.4 DNA片段測序
將回收的片段送至生物公司測序，測序引物為16S rDNA通用引物。
1.4砷氧化菌株的生長情況監(jiān)測：
1.4.1菌株在砷脅迫和無砷脅迫中生長曲線的測定
分別以1%接種量至TSB培養(yǎng)基和1m mol/L As(III)的TSB培養(yǎng)基中搖床培養(yǎng)(37℃，200r/min)，每隔2h取樣，用紫外分光光度計在OD600測其吸光值。以時間t(h)為橫坐標，OD600值為縱坐標，繪制菌株的生長曲線圖。
1.4.2菌株對砷的耐受性
在斜面上用接種針取一環(huán)菌種至5mL TSB培養(yǎng)基中,搖瓶培養(yǎng)12h(200r/min，30℃)。取下將菌液搖勻，以1%接種量分別接種于含As(III)的TSB試管培養(yǎng)基，置于搖床培養(yǎng)。砷濃度分別是0、1、10、30、35、40、45、50、55、60、65 m mol/L，培養(yǎng)20h，菌株的菌密度值用分光光度計OD600測定。
1.4.3菌株對重金屬銅的耐受性
在斜面上用接種針取一環(huán)菌種至5mL TSB培養(yǎng)基中，搖瓶培養(yǎng)12h(200r/min，30℃)。取下將菌液搖勻，以1%接種量分別接種于含Cu2+的TSB試管培養(yǎng)基，置于搖床培養(yǎng)。砷濃度分別是0、0.2、0.4、0.7、1.0m mol/L，培養(yǎng)20h，菌株的菌密度值用分光光度計OD600測定。
2結果與分析
2.1篩選砷耐受菌及其砷氧化能力的鑒定：
分離得到并命名為11號菌株對砷氧化能力明顯。在含1mM As(Ⅲ)的TSB培養(yǎng)基中培養(yǎng)11號菌，12h后取培養(yǎng)液上清與AgNO3溶液反應，并與As(Ⅴ)/As(Ⅲ)梯度溶液于AgNO3溶液反應對比，發(fā)現(xiàn)11號菌株在培養(yǎng)12h后其上清液與AgNO3溶液發(fā)生反應后顏色同As(Ⅴ)/As(Ⅲ)梯度溶液100/0接近，可推斷出該菌株氧化能力接近100%.
2.2砷氧化菌株16S rRNA基因測序鑒定菌種：
2.2.1 PCR擴增電泳分析
圖1泳道1～4為PCR產(chǎn)物，M道為標準核酸分子量MARKER
由圖2可以看出，16S rRNA大小為1.5KB左右，圖中1～4道電泳條帶單一，分子量符合，可以進行下一步測序。
2.2.2菌株16S rRNA基因測序結果：
2.2.3構建進化樹：
圖2根據(jù)11號菌16srRNA測序結果構建進化樹
根據(jù)上述結果初步確定11號菌屬于假單胞菌屬(pseudomonas)，而已有假單胞菌屬被發(fā)現(xiàn)有對砷的氧化還原代謝能力。
2.3在砷脅迫下菌株生長曲線測定：
圖4可以看出，菌株8 h達到生長的對數(shù)期，12～28h達到生長的穩(wěn)定期。砷的加入并不改變菌體的生長規(guī)律，而在砷脅迫下砷對菌體的生長有一定的抑制作用。
2.4菌株對砷的耐受性分析：
含砷量越高，砷對菌的生長抑制越大。當水中As(Ⅲ)達65mM/L時，菌的生長出現(xiàn)了停止，說明菌株對As(Ⅲ)的耐受量為65mM/L.
2.5菌株對銅的耐受性分析：
含銅離子濃度越高，其對菌的生長抑制越大。當水中Cu2+達1mM/L時，菌的生長出現(xiàn)了停止，說明菌株對Cu2+的耐受量1mM/L.
圖5菌株對銅的耐受性
3展望
對微生物砷代謝機制的研究發(fā)現(xiàn)，微生物的砷甲基化和微生物對砷的氧化作用都可以將As(Ⅲ)轉化為毒性較低的有機砷或As(Ⅴ)。如何利用微生物對砷污染環(huán)境進行修復已成為國內(nèi)外關注的焦點，因此生物修復被認為是修復砷污染環(huán)境的重要手段。本研究發(fā)現(xiàn)的這株砷氧化菌，能在As(Ⅲ)環(huán)境下氧化As(Ⅲ)為As(Ⅴ)，降低環(huán)境中的毒性，同時完成自身的生長。對As(Ⅲ)的耐受量為65mM/L，相較已報道的CLL-B7[10]，其耐受性達到CLL-B7的1.5倍，有很高的研究價值。后續(xù)將針對其砷環(huán)境脅迫中的相關基因表達及重要代謝循環(huán)的過程變化研究其對砷的氧化代謝機制。
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