牙菌斑可緊密附著在牙齒表面，與齲齒、根尖周病、牙周炎等多種口腔疾病有關(guān)?？紤]到牙菌斑去除的難度，感染性口腔疾病的治療和預(yù)防已成為一項挑戰(zhàn)。在此基礎(chǔ)上，在牙科實踐中應(yīng)使用一些防腐劑。氯己定(CHX)是一種陽離子殺菌劑，由于其正電荷，可以附著在帶負電荷的細胞表面。在低濃度下，CHX會改變細菌的細胞膜通透性，影響細菌細胞膜酶的活性，導(dǎo)致細胞成分的滲漏。戈登鏈球菌、糞腸球菌、牙齦卟啉單胞菌和具核梭桿菌在連續(xù)接觸CHX后也顯示出對CHX的抗性。伴隨放線菌聚合桿菌、中間普氏菌和遠緣鏈球菌在反復(fù)接觸CHX后也產(chǎn)生了CHX抗性。此外所有耐藥菌株都顯示出對其他防腐劑的交叉耐藥性。耐藥菌株的出現(xiàn)增加了治療的復(fù)雜性和成本。變形鏈球菌是齲齒的主要致病菌之一。迄今為止，關(guān)于變形鏈球菌對CHX抗性的研究很少，關(guān)于變形鏈球菌是否會產(chǎn)生CHX抗性的結(jié)論存在爭議。
在本研究中，四種不同的變形鏈球菌菌株，包括兩種標準菌株（變形鏈球菌ATCC 25175和變形鏈球菌UA 159）和兩種臨床分離株（變形鏈球菌593和變形鏈球菌18，其中分別從有齲齒的成人和無齲齒的成人中分離出來）。本論文的研究的目的是調(diào)查長期使用CHX是否會導(dǎo)致變形鏈球菌產(chǎn)生耐藥性，并探索可能的相關(guān)機制。
Bioscreen全自動生長曲線分析儀的應(yīng)用
使用了Bioscreen C全自動生長曲線分析儀在pH 5.5的培養(yǎng)基模擬酸性環(huán)境下觀察變形鏈球菌的生長，評估了生長曲線和酸性培養(yǎng)基對細菌的影響，將過夜培養(yǎng)物接種到pH 7.0和pH 5.5的BHI肉湯中。然后將細菌懸浮液置于微量滴定板中。OD600濁度值使用Bioscreen C生長曲線分析儀（在37°C下以30分鐘間隔檢測培養(yǎng)物的24小時，并在讀數(shù)前搖動10秒。
實驗結(jié)果
CHX（氯己定）被認為是牙科領(lǐng)域的金標準防腐劑。變形鏈球菌對CHX的抗性存在爭議。然而這項研究證實，在反復(fù)接觸CHX后，變形鏈球菌會產(chǎn)生抗藥性。消除一般變形鏈球菌后，SM-Cs具有相同的致齲性細胞表面疏水性的增加和LTA的D-丙氨酰化水平可能是變形鏈球菌CHX抗性的潛在機制。由于變形鏈球菌可以對CHX產(chǎn)生抗性，因此需要改進CHX和/或開發(fā)新的防腐劑來替代CHX。
圖1、選擇敏感性降低的突變體。變形鏈球菌593(A)、變形鏈球菌ATCC 25175(B)、變形鏈球菌18(C)和變形鏈球菌UA 159(D)暴露于CHX 10次。CHX對四種變形鏈球菌菌株的MIC值（y軸）在第0至10代（x軸）后重復(fù)測定。數(shù)據(jù)顯示為平均MIC值±SD。
圖2、親本菌株和SM-Cs的形態(tài)。TEM圖顯示了來自變形鏈球菌593（A,×15k和B，×30k）和SM 593-C（C，×15k和D，×30k）的細胞形態(tài)。
圖3、在pH 7.0的BHI培養(yǎng)基中生長的四種變形鏈球菌菌株和SM-Cs的生長曲線。變形鏈球菌593(A)、變形鏈球菌ATCC 25175(B)、變形鏈球菌18(C)和變形鏈球菌UA 159(D)的OD600(y軸)，每隔30分鐘檢測一次。
圖4、四種變形鏈球菌菌株和SM-Cs的致齲性。(AD)在pH 5.5的BHI培養(yǎng)基中生長的四種變形鏈球菌菌株和SM-Cs的生長曲線。變形鏈球菌593(A)、變形鏈球菌ATCC 25175(B)、變形鏈球菌18(C)和變形鏈球菌UA 159(D)和SM-Cs(AD)的OD 600（y軸）分別為每隔30分鐘檢測一次。(E)四個變形鏈球菌菌株及其CHX抗性菌株(x軸)的生物膜生物量(y軸)。
圖5、變形鏈球菌抗CHX的可能機制。(AD)dltC、dltD、SMU.862、BceA和BceR基因在四個變形鏈球菌菌株及其CHX抗性菌株中的表達水平（y軸）。(E)四種變形鏈球菌菌株及其CHX抗性菌株的細胞表面疏水性。通過細胞對N-十六烷的粘附率(y軸)評估細胞表面疏水性。(F)CHX對變形鏈球菌野生型和衍生物的MIC。
總結(jié)
氯己定（CHX）被認為是預(yù)防齲齒的金標準，并廣泛應(yīng)用于牙科實踐。然而長期使用CHX可能會導(dǎo)致口腔病原體對CHX產(chǎn)生耐藥性。本論文研究的目的是調(diào)查長期使用CHX是否會導(dǎo)致變形鏈球菌產(chǎn)生耐藥性，并探索可能的相關(guān)機制。本研究選擇了四種不同的變形鏈球菌菌株以排除菌株的特異性。這四種菌株在暴露于CHX 10代后顯示出最小抑制濃度(MIC)的增加。變形鏈球菌CHX抗性菌株(SM-Cs)的特征和致齲性暴露于CHX 10代，MIC增加，與親本菌株沒有顯著差異。SM-Cs比親本菌株更具疏水性。dltC和dltD基因在SM-Cs中上調(diào)。SM-Cs中BceA、BceR和SMU.862基因的相對表達與親本菌株相似或低于親本菌株。dltC敲除突變體的MIC值顯著降低。這些發(fā)現(xiàn)證實持續(xù)暴露于CHX可誘導(dǎo)變形鏈球菌對CHX的抗性。細胞表面疏水性增加和dlt操縱子表達上調(diào)可能是變形鏈球菌中CHX抗性的潛在機制。
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