主要結(jié)果
1、通過比較膿毒癥患者和HCs之間的微生物群來區(qū)分膿毒癥相關(guān)細菌
首先，我們比較了膿毒癥組和HC組之間的α多樣性和β多樣性。膿毒癥患者的腸道α多樣性明顯低于HCs患者(Shannon指數(shù)2.146 vs.2.911,p<0.01;圖2A)和不同的微生物結(jié)構(gòu)(ANOSIM檢驗，p=0.001;圖2B)。膿毒癥和HCs組流行菌分布如圖2C所示。膿毒癥患者的變形菌門和腸球菌科數(shù)量增加，厚壁菌門和毛螺桿菌科數(shù)量明顯減少。LefSe發(fā)現(xiàn)，膿毒癥患者的健康促進菌群(如Blautia、Anaerostipes、Bifdobacterium和Eubacterium_hallii)豐度也顯著減少。相反，醫(yī)院內(nèi)感染常見的腸球菌(Enterococcus)和克雷伯菌(Klebsiella)在膿毒癥患者中的富集程度高于HCs(圖2C,D)。此外，與HC相比，膿毒癥患者的細菌關(guān)系網(wǎng)絡(luò)不那么復(fù)雜，其中腸球菌對其他分類群表現(xiàn)出異常的抑制作用(圖2E)。
2、膿毒癥患者代謝特征與微生物群改變的相關(guān)性
接下來，我們對膿毒癥和HCs患者的糞便樣本進行了非靶向代謝組學(xué)分析。共鑒定出449種注釋的差異代謝物，膿毒癥組中有10種(2.23%)比HC組豐富，表明這些患者的代謝活性可能減弱(圖1B和3A)。PCA分析顯示，兩組患者在正離子和負離子模式下的代謝譜不同(圖3B)。我們評估了各種變量對代謝組的影響，發(fā)現(xiàn)抗生素的使用數(shù)量可能會影響代謝組成。利用基于KEGG注釋的代謝富集途徑分析，將膿毒癥改變的代謝物映射到它們的生化途徑(圖3C)。在81個潛在的功能差異代謝物中，驗證組檢測到38個，我們將其定義為膿毒癥相關(guān)代謝物(圖1B)。我們還評估了膿毒癥患者中膿毒癥相關(guān)代謝物與其他參數(shù)之間的關(guān)系，并認為只有在驗證組中證實的相關(guān)性是可靠的(圖1C)。
差異代謝物似乎與氨基酸代謝密切相關(guān)，包括色氨酸、酪氨酸、精氨酸和脯氨酸代謝。參與不平衡的嘌呤代謝、植物次生代謝物的生物合成和ABC轉(zhuǎn)運蛋白也被觀察到?？紤]到腸道微生物和代謝物之間的密切聯(lián)系，我們評估了改變的分類群與膿毒癥相關(guān)代謝物的相關(guān)性(圖3D)。發(fā)現(xiàn)多種細菌與這些關(guān)鍵代謝物密切相關(guān)。在前五名中，有四名屬于毛螺菌科，表明該細菌家族具有強大的代謝調(diào)節(jié)功能。值得注意的是，OTU808(Enterococcus faecium)與代謝物幾乎呈負相關(guān)，這與上述腸球菌與膿毒癥腸道微環(huán)境中其他細菌的抑制關(guān)系類似。此外，我們還鑒定了10種與細菌最密切相關(guān)的代謝物:3-甲基二氧吲哚、5-羥基吲哚乙酸、多巴醌、N,N-二羥基苯基丙氨酸、異煙酸、脫氧膽酸、2-羥基肉桂酸、4-羥基苯甲醛、胸腺嘧啶和十六烯二酸。其中6種是芳香化合物，可能來源于芳香氨基酸(AAA)的代謝物，包括色氨酸、酪氨酸和苯丙氨酸。其中，參與色氨酸代謝的代謝物3-甲基二氧吲哚與膿毒癥患者腸道微生物的相關(guān)性最大。
3、腸道微生物和代謝結(jié)構(gòu)與膿毒癥臨床嚴重程度的一致性
接下來研究了腸道微生物組和代謝物對膿毒癥嚴重程度的潛在影響。如圖4A所示，該組患者根據(jù)其腸道微生物組成(也稱為腸型)大致可分為三個亞組。在腸型1(E1)中占優(yōu)勢的是毛螺科和瘤胃球菌科;腸型2(E2)以腸球菌為主;腸型3(E3)富含擬桿菌和志賀氏桿菌(圖4B)。腸型比較顯示，E3期患者最為關(guān)鍵，APACHE II評分≥18的比例明顯高于非E3期患者(46%vs.12%，p=0.040;圖4C)。此外，E3組患者SOFA評分≥10分、ICU住院≥30天的比例可能更高，死亡率也最高，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義。盡管E2組患者細菌多樣性和豐富度似乎低于其他腸型，但疾病并不比其他腸型更嚴重。
我們還分析了優(yōu)勢菌群與存活膿毒癥患者臨床指標之間的相關(guān)性。分析顯示，OTU773(B.vulgatus)和OTU822（Rikenellaceae）與ICU住院時間顯著正相關(guān)(圖4D)。此外，在ICU期間出現(xiàn)并發(fā)癥的患者OTU773負荷明顯較高，但OTU808(E.faecium)負荷沒有差異(圖4E)。OTU773在膿毒癥死亡的患者中更豐富(圖4F)。這些結(jié)果提示B.vulgatus與膿毒癥患者預(yù)后不良相關(guān)。其他細菌如微球菌科的Akkermansia和OTU40，可能對膿毒癥患者有益。OTU40與APACHE II評分呈負相關(guān)，而Akkermansia屬(已知對許多人類疾病具有保護作用)的豐度在未存活的膿毒癥患者的腸道微生物群中較低。
對腸道代謝物與膿毒癥疾病嚴重程度之間相關(guān)性的可靠性評估發(fā)現(xiàn)，有三種化合物與ICU住院時間呈負相關(guān)(圖4G)。此外，我們觀察到兩種與膿毒癥相關(guān)的代謝物在非存活患者中減少。五種代謝物中有四種是芳香化合物，參與氨基酸代謝，特別是色氨酸和酪氨酸的代謝。5-羥基吲哚乙酰甘氨酸也與APACHE II評分呈正相關(guān)，揭示了腸道衍生代謝物與膿毒癥之間復(fù)雜的相互作用網(wǎng)絡(luò)(圖4G)。我們還觀察到，未存活的患者具有豐富的犬尿氨酸（也是色氨酸代謝物）豐度，但在驗證組中未檢測到。我們觀察到這些色氨酸代謝物的豐度在接受不同數(shù)量抗生素的患者中保持可比性，表明色氨酸代謝的擾動可能與使用的抗生素數(shù)量無關(guān)。研究結(jié)果總體表明，色氨酸代謝物在膿毒癥進展中起著關(guān)鍵作用。
4、膿毒癥大鼠腸道菌群和腸道基因表達的變化
即使我們對糞便標本的評估與臨床實踐中經(jīng)常遇到的標本類型非常接近，理論上也很難消除臨床各種藥物對人體腸道微生物群的干擾。因此，我們試圖在動物模型中證實膿毒癥隊列患者的膿毒癥相關(guān)微生物特征。我們觀察到腹腔感染膿毒癥患者與肺部感染膿毒癥患者具有相似的微生物組結(jié)構(gòu)，我們在大鼠中建立了由腹腔感染引起的經(jīng)典膿毒癥CLP模型。與患者組和HC組相似，膿毒癥大鼠組腸道微生物組成與假手術(shù)組存在差異(圖5A)。同樣，在膿毒癥大鼠中，必需益生菌(包括Muribaculaceae和Butyricicoccus)的比例下降，而機會致病菌(如Enterobacteraceae和Enterococcus)的比例則增加(圖5B)。值得注意的是，盡管膿毒癥組患者和HC組的糞便標本中B.vulgatus的負荷相當，但膿毒癥大鼠腸道中B.vulgatus的豐度有所增加，B.vulgatus的豐度與膿毒癥患者的不良預(yù)后有關(guān)。
為了進一步闡明膿毒癥相關(guān)關(guān)鍵細菌的功能，我們評估了細菌豐度譜與腸道基因表達譜之間的關(guān)系。最初，我們重點研究了膿毒癥大鼠腸道轉(zhuǎn)錄組的變化。通過KEGG分析來確定DEGs的功能富集(圖5C)。對于回腸和結(jié)腸，發(fā)現(xiàn)大量在膿毒癥中上調(diào)的基因參與了細胞因子-細胞因子受體相互作用和趨化因子信號通路，反映在免疫激活上。多種細胞粘附分子在膿毒癥結(jié)腸中下調(diào)，表現(xiàn)為細胞外基質(zhì)(ECM)受體與轉(zhuǎn)化生長因子-β信號通路相互作用的功能減弱，這有助于免疫細胞的募集和腸道通透性的增強。另一個顯著的變化是脂質(zhì)代謝途徑。許多下調(diào)的基因與類固醇激素的生物合成、過氧化物酶體增殖物激活受體(PPAR)信號通路和膽固醇代謝有關(guān)。膽固醇是幾種具有抗炎功能的激素的前體，脂肪酸及其衍生物可激活PPAR信號通路，有效改善膿毒癥的炎癥損傷。此外，與外源性藥物代謝相關(guān)的通路在膿毒癥中也減弱了。該通路通過腸道代謝物激活芳烴受體(AhR)和孕烷X受體(PXR)，隨后與核因子-κB信號轉(zhuǎn)導(dǎo)相互作用，發(fā)揮抗炎功能。
接下來，通過STRING構(gòu)建DEGS的蛋白質(zhì)相互作用表達網(wǎng)絡(luò)。圖5D顯示了四個中心DEG。關(guān)于結(jié)腸中的核心DEG，PLG協(xié)助ECM破壞和中性粒細胞遷移，IL6參與炎癥，ApoB和APOE是脂蛋白載體的組成部分，可能通過結(jié)合內(nèi)毒素或其他毒素來調(diào)節(jié)免疫過程。關(guān)于回腸中的DEG，CD44、Vcam1和CXCR4服務(wù)于免疫細胞聚集過程，而MMP9降解黏附物質(zhì)以促進細胞運動。綜上所述，膿毒癥的腸道轉(zhuǎn)錄組揭示了與各種類型的宿主反應(yīng)相關(guān)的炎性風(fēng)暴。
5、膿毒癥大鼠腸道轉(zhuǎn)錄組中特定細菌的不同相互作用
之前，我們提出擬桿菌和腸球菌是重要的膿毒癥相關(guān)細菌，可能對疾病進展有不同的影響。因此，我們對微生物豐度和腸道基因表達進行了相關(guān)性分析，以確定腸道微生物在膿毒癥的病理生理學(xué)中的潛在作用。結(jié)腸的結(jié)果如圖6所示。我們能夠區(qū)分出三個細菌簇（簇1-3）和三個基因簇（簇A-C）。簇1主要包含腸球菌和腸桿菌科，與簇A的基因呈正相關(guān)，這些基因在炎癥反應(yīng)（Cybb、Tlr2）和ECM破壞（Mmp13、Spp1）中發(fā)揮作用。此外，來自腸桿菌科的簇1生物與與脂質(zhì)代謝相關(guān)基因（Apoc3，Apob）的關(guān)系比來自腸球菌的基因更密切。與簇1相比，簇2表現(xiàn)出完全不同的關(guān)聯(lián)趨勢。擬桿菌屬物種聚集在簇3中，與簇B中的一些基因發(fā)生了顯著的相互作用。在這些基因相互作用中，Mmp9是一種參與屏障破壞的、研究較為深入的金屬蛋白酶，與擬桿菌屬物種呈正相關(guān)，而編碼胱硫氨酸-γ-裂解酶的Cth，則與擬桿菌屬物種呈負相關(guān)，Cth是一種主要的內(nèi)源性硫化氫產(chǎn)生酶，通過IL-8信傳導(dǎo)抑制炎癥，呈負相關(guān)。
討論
研究亮點
使用微生物組和非靶向代謝組學(xué)的組合來分析入院時膿毒癥患者的糞便樣本，然后篩選出可能在疾病結(jié)局中發(fā)揮重要作用的微生物群，代謝物和潛在的信號通路。最后，通過膿毒癥動物模型的微生物組學(xué)和轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析驗證了上述結(jié)果。
局限性
首先，研究的樣本量較小，所有參與者都來自同一個醫(yī)療中心；因此，我們的結(jié)果應(yīng)該在其他機構(gòu)的患者中得到驗證。其次，盡管我們的研究結(jié)果在控制年齡時仍然顯著，并在大鼠模型中得到驗證，但臨床混雜因素仍然存在，包括入ICU前的藥物治療和感染的病原體。第三，腸球菌和普通雙歧桿菌對膿毒癥的影響是通過相關(guān)性分析推斷出來的，應(yīng)該通過對特定細菌定植的動物實驗來驗證。未來的研究應(yīng)使用宏基因組學(xué)技術(shù)來精確揭示與膿毒癥腸道代謝物改變有關(guān)的微生物遺傳元素的功能。
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