1材料與方法
1.1供試昆蟲與線蟲
大蠟螟Galleriamellonella由甘肅農業(yè)大學植物保護學院甘肅省農作物病蟲害生物防治工程實驗室提供，實驗用大蠟螟3齡幼蟲經滯育處理，以防止吐絲、化蛹。采用對蠐螬、韭蛆及模式昆蟲大蠟螟致病力及生物學特性較好的昆蟲病原線蟲卡森斯氏線蟲0657L，均由大蠟螟老熟幼蟲培養(yǎng)、繁殖，懸浮液貯存于4℃?zhèn)溆谩?
1.2試劑與器材
胰島素母液(1 mL pH 2鹽酸溶液加入1 mg胰島素干粉，胰島素干粉購于生工生物工程上海股份有限公司，純度>95%);蒸餾水;75%酒精;林格氏液(蒸餾水1 000 mL，氯化鈉8.6 g，氯化0.3 g，氯化鈣0.28 g)。NBTB培養(yǎng)基:無菌水1 000 mL，瓊脂15 g，LB瓊脂預混干粉40 g，溴百里酚藍0.01 g，搖勻，121℃，1 240 Pa滅菌20 min。LB培養(yǎng)基:營養(yǎng)肉湯8 g，瓊脂15 g，酵母粉5 g，六水合氯化鎂(MgCl2·6H2O)2 g，蒸餾水900 mL，搖勻，121℃，1 240 Pa滅菌20 min。玉米糖漿7 mL，玉米胚芽油4 mL，蒸餾水89 mL，混合均勻，加入無菌的培養(yǎng)液中。TSY液體培養(yǎng)基:胰蛋白胨大豆肉湯40 g/L，酵母提取物5 g/L。
體視顯微鏡(Stemi 305，德國Zeiss公司)，高壓滅菌鍋(GI54DWS，致微儀器有限公司)，超凈工作臺(HCB-1300V，青島海爾生物醫(yī)療股份有限公司)，二氧化碳光照培養(yǎng)箱(SPX-250-GB-CO2，上海躍進器械醫(yī)療有限公司)，冰箱(BCD-656 WDPT，青島海爾股份有限公司)，超純水儀(GWB-2，北京普析通用儀器有限責任公司)，電子天平(ER-180，AND)，玻璃棒，酒精燈，9 cm培養(yǎng)皿，3.5 cm培養(yǎng)皿，移液槍，圓形濾紙，剪刀，接種環(huán)，封口膜，脫脂棉等。
1.3卡森斯氏線蟲0657L侵染大蠟螟后共生細菌的分離、純化和鑒定
將經過75%酒精體表消毒的大蠟螟3齡幼蟲(生理活性基本一致)各5頭置于墊有兩層無菌濾紙的培養(yǎng)皿中，吸取1.5 mL 3 000頭/mL的卡森斯氏線蟲0657L懸浮液侵染大蠟螟，25℃培養(yǎng)24 h后將大蠟螟第1對胸足末端剪破，從蟲體尾部向前按壓至被共生細菌侵染的大蠟螟的血液從傷口處滴落在NBTB培養(yǎng)基上。用接菌環(huán)蘸取大蠟螟體液劃Z字型后密封培養(yǎng)基，置于25℃培養(yǎng)箱中，待菌體長出，吸收培養(yǎng)基中溴百里酚藍染料且菌體呈綠色的則確定為昆蟲病原線蟲共生細菌(楊亞賢等，2023)。將單菌落轉移至新的NBTB平板培養(yǎng)基上，繼續(xù)劃線進行共生細菌的二次純化，以此重復，直到培養(yǎng)純化出均勻的單菌落。
挑取其中的初生型單菌落轉移至LB平板培養(yǎng)基，在25℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)72 h后將共生細菌單菌落挑取至TSY培養(yǎng)基中，在28℃180 r/min搖床中培養(yǎng)48 h，得到共生細菌發(fā)酵液，4℃保存?zhèn)溆谩＝浾n題組鑒定，卡森斯氏線蟲0657L的共生細菌為伯氏致病桿菌Xenorhabdusbovenii0657L(張文德等，2023)。在LB培養(yǎng)基上接種上述純化的共生細菌伯氏致病桿菌0657L作為卡森斯氏線蟲0657L的食物，25℃恒溫培養(yǎng)。
1.4胰島素對卡森斯氏線蟲0657L壽命、運動能力和吞咽能力的影響的測定
在光學顯微鏡下將卡森斯氏線蟲0657L懷卵大母蟲挑至新的用劃線法培養(yǎng)有伯氏致病桿菌0657L的LB培養(yǎng)基中，子代產出后將大母蟲挑走，子代繼續(xù)置于25℃中培養(yǎng)。為了抑制卡森斯氏線蟲0657L產卵，子代幼蟲期的第0-5天LB中含5μmol/L五氟尿嘧啶，待卡森斯氏線蟲0657L生長至第6天時轉至普通的LB上，此時的線蟲生長至同一生長時期J3。
挑取NBTB培養(yǎng)基上菌落大小一致(挑取的菌量也基本一致)的伯氏致病桿菌0657L單菌落至直徑3.5 cm的LB培養(yǎng)基上，隨機分為8組，隨后每個單菌落立即分別滴加10μL胰島素母液與林格氏液體積比為1∶500和1∶5 000及林格氏液(現(xiàn)配現(xiàn)用)，另設1組不加胰島素和林格氏液的空白對照，處理后每24 h在體視顯微鏡下用十字交叉法測量菌落直徑1次并記錄，計算1～6 d時伯氏致病桿菌0657L的生長速率，生長速率(%)=(Dt-Dt-1)/t×100(D為共生細菌單菌落直徑;t為時間，單位d)。將同期化J3卡森斯氏線蟲0657L轉移到上述胰島素處理48 h時的伯氏致病桿菌0657L的LB上培養(yǎng)，此時記為實驗第0天。為保證食物充足和藥物濃度，每3 d將卡森斯氏線蟲0657L轉移至新的接有胰島素處理的伯氏致病桿菌0657L的LB上，每天監(jiān)測卡森斯氏線蟲0657L的存活情況，直至所有卡森斯氏線蟲0657L死亡(卡森斯氏線蟲0657L對鉑絲的輕微機械觸碰無反應即視為死亡)，記錄存活時間，計算壽命和存活率。每組至少3個重復，每個重復30條線蟲。
隨機選取胰島素處理3 d(3齡幼蟲)，7 d(4齡幼蟲)和11 d(成蟲)時的卡森斯氏線蟲0657L挑取至未培養(yǎng)伯氏致病桿菌0657L的空白LB培養(yǎng)基上，使其在自由運動過程中除掉蟲身黏附的共生細菌后，記錄30 s內卡森斯氏線蟲0657L頭部來回擺動的次數(shù)(即為衡量卡森斯氏線蟲0657L運動能力的標準)，從一側擺動到另一側再擺回來視為1次。每組至少5條線蟲，每條線蟲統(tǒng)計至少統(tǒng)計3次，取其平均值作為最終結果。隨機選取胰島素處理3 d(3齡幼蟲)，7 d(4齡幼蟲)和11 d(成蟲)時的卡森斯氏線蟲0657L，直接在卡森斯氏線蟲0657L生長培養(yǎng)基上對其30 s內吞咽次數(shù)進行統(tǒng)計，用鉑絲輕輕觸碰卡森斯氏線蟲0657L，觀察并記錄卡森斯氏線蟲0657L咽部中食道球前后抽動次數(shù)。每組至少5條卡森斯氏線蟲0657L。每條卡森斯氏線蟲0657L至少統(tǒng)計3次，取其平均值作為最終結果。
1.5數(shù)據分析
卡森斯氏線蟲0657L壽命數(shù)據采用long rank test統(tǒng)計方法，伯氏致病桿菌0657L菌落直徑和生長速率以及卡森斯氏線蟲0657L運動和吞咽數(shù)據采用LSD多重比較法進行差異顯著性分析，所用分析及作圖軟件包括Excle 2016，SPSS 19.0和Origin 2021等。
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