細(xì)菌計(jì)數(shù)方法是微生物學(xué)研究的基礎(chǔ)技術(shù)，主要分為直接計(jì)數(shù)法和間接培養(yǎng)計(jì)數(shù)法。直接計(jì)數(shù)法主要有顯微鏡觀察法(包括光學(xué)顯微鏡技術(shù)、熒光顯微鏡技術(shù)等)和比濁計(jì)數(shù)法等；間接培養(yǎng)計(jì)數(shù)法主要有平板菌落計(jì)數(shù)法(包括傳統(tǒng)平板計(jì)數(shù)法、微菌落技術(shù)等)和最大或然數(shù)計(jì)數(shù)法(Most probable number，MPN法，也稱為稀釋培養(yǎng)法)等(王婷婷等,2008)。傳統(tǒng)的直接計(jì)數(shù)法不能區(qū)分細(xì)菌的死活，且靈敏度低、線性范圍狹窄，間接培養(yǎng)計(jì)數(shù)法雖然能確定活菌數(shù)量，但工作量大，難以對(duì)大批量樣品進(jìn)行同時(shí)操作。例如，食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)中的菌群計(jì)數(shù)法采用MPN法和平板計(jì)數(shù)法(GB 4789.3-2010)，這2種方法都需要培養(yǎng)24～48 h，且工作量大、檢測(cè)線性范圍窄，難以進(jìn)行快速、大批量的檢測(cè)工作，MPN法的精確性還存在疑問(wèn)；為了簡(jiǎn)化檢測(cè)程序、縮短檢測(cè)時(shí)間，國(guó)內(nèi)外學(xué)者進(jìn)行了大量的快速檢測(cè)方法的研究，提出了電阻抗檢測(cè)法、Sim PlateTM全平皿計(jì)數(shù)法、微菌落技術(shù)、最大或然數(shù)-聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)計(jì)數(shù)法(MPN-PCR法)、流式細(xì)胞儀測(cè)定法等檢測(cè)方法，取得了一定的成果，但也存在不同的缺陷和不足。例如，流式細(xì)胞儀測(cè)定法雖然靈敏度、簡(jiǎn)便性都有了較大的提升，但由于其成本昂貴，且不能區(qū)分細(xì)菌的死活，在實(shí)際應(yīng)用中受到了很大的制約。
MTT是3-(4,5-二甲基噻唑-2)-2,5-二苯基四氮唑溴鹽，能穿過(guò)細(xì)胞膜被活細(xì)胞線粒體中的琥鉑酸脫氫酶還原，形成藍(lán)紫色不溶于水的甲瓚(Formazan)(Mosmann,1983)，死細(xì)胞酶活性喪失而沒(méi)有顏色反應(yīng)。用有機(jī)溶劑溶解甲瓚后(邊興艷,1998)，測(cè)定溶液的吸光度(OD值)而確定活細(xì)胞數(shù)(Gerlieret al,1986)。該法快速、經(jīng)濟(jì)、操作相對(duì)簡(jiǎn)便、重復(fù)性較好，近年來(lái)被廣泛應(yīng)用到大腸桿菌(Escherichia coli)(王栩等,2002)、保加利亞乳桿菌(Lactobacillus bulgaricus)、嗜熱鏈球菌(Streptococcus thermophilus)(黃立坤等,2008)、伴放線菌嗜血菌(Haemophilus actinomycetemcomitans)(王忠朝等,2010)和酵母菌(龔加路等,2016)等的活菌計(jì)數(shù)中。
三磷酸腺苷(ATP)是所有生命活動(dòng)的能量載體(Veltenet al,2007)，活細(xì)菌中ATP含量會(huì)維持在一定范圍，細(xì)菌死亡后ATP會(huì)在短時(shí)間內(nèi)被細(xì)胞內(nèi)酶所分解(Holm-Hansenet al,1966)，樣品中ATP含量即可間接反映活細(xì)菌數(shù)量。ATP生物發(fā)光法(Milleret al,1992;Selanet al,1992;Nyrén,1994;McElroyet al,1949)是熒光素酶在Mg2+條件下催化熒光素與ATP反應(yīng)形成熒光素-AMP的復(fù)合物，與O2結(jié)合時(shí)發(fā)光，發(fā)光強(qiáng)度與ATP濃度呈線性關(guān)系，從而檢測(cè)活菌的數(shù)量(Moyeret al,1983;Gr?nrooset al,1983)。ATP生物發(fā)光法操作簡(jiǎn)便，能快速得到結(jié)果，與傳統(tǒng)的平板計(jì)數(shù)法相比，不僅能區(qū)分細(xì)菌的死活，而且還能檢測(cè)出不可培養(yǎng)的微生物(Hammeset al,2010)。
借鑒實(shí)時(shí)定量PCR的擴(kuò)增曲線原理，利用微生物類似于PCR擴(kuò)增的指數(shù)生長(zhǎng)曲線(Brewster,2003)，建立了高通量生長(zhǎng)曲線法，該法與傳統(tǒng)的MPN法完全不同，是根據(jù)細(xì)菌生長(zhǎng)達(dá)到特定濁度的時(shí)間進(jìn)行活菌的計(jì)數(shù)，在微孔板的微量培養(yǎng)體積上，設(shè)置多個(gè)平行，以高通量的方式對(duì)微生物的生長(zhǎng)進(jìn)行實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)，達(dá)到類似實(shí)時(shí)定量PCR那樣在極寬的線性范圍進(jìn)行微生物的準(zhǔn)確計(jì)數(shù)的效果。在上述背景下，本研究對(duì)MTT比色法、ATP生物發(fā)光法和高通量生長(zhǎng)曲線法進(jìn)行了比較。
各初始濃度菌液的生長(zhǎng)曲線
結(jié)果：
平板計(jì)數(shù)作為活菌計(jì)數(shù)的最基本方法，通常能應(yīng)用于大多數(shù)需要進(jìn)行活菌計(jì)數(shù)的場(chǎng)合，但在一些研究不同培養(yǎng)條件，例如液體發(fā)酵(高戈等,2017)或固體發(fā)酵(孫靜等,2017)等；理化因素，例如消毒劑或紫外線等處理；藥物制劑，例如中草藥或抑菌劑等；這些對(duì)特定細(xì)菌生長(zhǎng)或存活的影響效果時(shí)，需要大量的活菌計(jì)數(shù)工作，而平板計(jì)數(shù)方法由于工作量大，材料消耗大，在用到這些大量研究對(duì)象時(shí)效率很低，且不確定度高(凌云等,2010)，因此，需要高效可靠的活菌計(jì)數(shù)方法。工作效率較高的細(xì)菌計(jì)數(shù)法可采用酶標(biāo)板的高通量OD值測(cè)定，但該方法并不能區(qū)分樣本中的活菌和死菌，而且如果樣本中存在大量帶顏色的或懸浮物等干擾光吸收的物質(zhì)時(shí)(孫靜等,2017)，就難以進(jìn)行直接的OD值測(cè)定。因此，需要其他的活菌計(jì)數(shù)方法以彌補(bǔ)在特定應(yīng)用中的不足。
MTT比色法操作相對(duì)簡(jiǎn)單，能滿足高通量操作的需求，適用于較高濃度的活菌數(shù)檢測(cè)，但其檢測(cè)的線性范圍只有2個(gè)數(shù)量級(jí)的跨度。當(dāng)活菌數(shù)較低時(shí)，MTT的反應(yīng)產(chǎn)物過(guò)低，從而在OD555 nm值太低而超出檢測(cè)的線性范圍，不適用于檢測(cè)濃度太低或太高的細(xì)菌，由于高通量分析實(shí)驗(yàn)的場(chǎng)合常常會(huì)有細(xì)菌數(shù)量大大偏離MTT檢測(cè)范圍的情況發(fā)生，這種方法實(shí)際上在高通量活菌計(jì)數(shù)的應(yīng)用中受到了較大局限，與之前報(bào)道的MTT比色法在大腸桿菌活菌計(jì)數(shù)研究的結(jié)論相符合(汪志榮等,2011)。對(duì)7.8×106～2.5×108CFU/ml線性范圍內(nèi)的實(shí)際樣品進(jìn)行檢測(cè)時(shí)，所得結(jié)果與平板計(jì)數(shù)結(jié)果有一定偏離，5×106CFU/ml以下的檢測(cè)結(jié)果可能會(huì)有明顯偏差。此外，不同種類和不同生理狀態(tài)的細(xì)菌中琥珀酸脫氫酶含量可能不同，對(duì)多種細(xì)菌混合檢測(cè)的適用性可能受影響。
ATP生物發(fā)光法操作更加簡(jiǎn)便，是3種方法中檢測(cè)速度最快的，準(zhǔn)確性比MTT法高，反應(yīng)速度較快，能對(duì)樣品進(jìn)行實(shí)時(shí)的檢測(cè)反饋，線性范圍能達(dá)到4個(gè)數(shù)量級(jí)的跨度。對(duì)1×104～3×108CFU/ml跨度的線性范圍內(nèi)的實(shí)際樣品進(jìn)行檢測(cè)時(shí)，所得結(jié)果與平板計(jì)數(shù)結(jié)果高度吻合，對(duì)104CFU/ml以下的檢測(cè)結(jié)果偏差明顯增加(Chenet al,2006)。在檢測(cè)較低濃度的活菌時(shí)，需要較長(zhǎng)的檢測(cè)時(shí)間來(lái)收集微弱的發(fā)光，對(duì)于大量樣品的高通量檢測(cè)來(lái)說(shuō)，順序檢測(cè)過(guò)程會(huì)造成前后樣品的時(shí)間差太大，ATP的發(fā)光會(huì)逐漸消散而對(duì)準(zhǔn)確性造成顯著影響(Selanet al,1992)。因此，該方法也不適于大樣本量的高通量檢測(cè)。此外，如果樣品中有其他來(lái)源的ATP干擾，也會(huì)對(duì)分析的準(zhǔn)確性產(chǎn)生很大的影響。
高通量生長(zhǎng)曲線法準(zhǔn)確性略低于ATP發(fā)光法，在本研究的手動(dòng)操作條件下，檢測(cè)的線性范圍達(dá)7個(gè)數(shù)量級(jí)以上，對(duì)特別低或特別高的活菌數(shù)都能進(jìn)行有效檢測(cè)。對(duì)100～107CFU/ml跨度的線性范圍內(nèi)的實(shí)際樣品進(jìn)行檢測(cè)時(shí)，所得結(jié)果與平板計(jì)數(shù)結(jié)果高度吻合，102CFU/ml以下的實(shí)際樣品檢測(cè)時(shí)有誤差增大的可能，與Brewster(2003)的研究結(jié)果相符。高通量生長(zhǎng)曲線法操作耗費(fèi)時(shí)間較長(zhǎng)，而且需要定時(shí)對(duì)OD值進(jìn)行測(cè)定，如果完全人工手動(dòng)操作，這個(gè)過(guò)程將較為辛苦。該方法不需要借助特別試劑，可以不受試劑缺乏的限制而得以應(yīng)用。如果有自動(dòng)生長(zhǎng)曲線測(cè)定儀，那這樣的操作將十分方便，而且能進(jìn)一步增加其檢測(cè)的線性范圍和結(jié)果的準(zhǔn)確性。
綜合比較3種高通量方法：ATP生物發(fā)光法與高通量生長(zhǎng)曲線法有很好的準(zhǔn)確性，MTT比色法準(zhǔn)確度稍差；而高通量生長(zhǎng)曲線法有最寬的線性范圍，也最適合高通量測(cè)定。