2結(jié)果
2.1產(chǎn)果膠酶菌株的分離篩選
利用產(chǎn)果膠酶的菌株可以使加溴酚藍(lán)的培養(yǎng)基產(chǎn)生黃色水解圈的原理，本實(shí)驗(yàn)從土壤、腐爛水果等生境復(fù)篩得到黃色水解圈較大的7株霉菌（見(jiàn)圖1和圖2），對(duì)其進(jìn)行Dp/Dc值及酶活性的測(cè)定，結(jié)果見(jiàn)表1.
圖1篩選所獲部分菌落圖
圖2 L5菌株的培養(yǎng)特征和形態(tài)特征
表17株產(chǎn)果膠酶菌株的Dp/Dc值和酶活性比較
由表1可以看出，菌株的酶活性隨著Dp/Dc值增大而增大，L5菌株的Dp/Dc值最高，相應(yīng)的酶活性為39940 U·min-1·mL-1.L5菌株是從浙江東陽(yáng)荷塘淤泥中篩選得到的。圖2（a）為L(zhǎng)5菌株在溴酚藍(lán)篩選培養(yǎng)基上的黃色水解圈照片。
2.2培養(yǎng)時(shí)間對(duì)L5菌株產(chǎn)果膠酶的影響
對(duì)每隔2 h取樣得菌體進(jìn)行干質(zhì)量測(cè)量，并繪制生長(zhǎng)曲線見(jiàn)圖3.由圖3可知：將菌體從種子培養(yǎng)基中接入搖瓶培養(yǎng)基約需0——10 h的停滯期；接著10——24 h,菌絲生長(zhǎng)，菌體質(zhì)量進(jìn)入對(duì)數(shù)期；其后曲線趨于平緩，24——68 h是菌體質(zhì)量的穩(wěn)定期；從68 h始，菌體開始自溶，進(jìn)入衰亡期。
每隔2 h測(cè)量一次L5菌株產(chǎn)生的果膠酶酶活性，以酶活性為縱坐標(biāo)、培養(yǎng)時(shí)間為橫坐標(biāo)繪制曲線（見(jiàn)圖3）。由圖3可知：在2——70 h內(nèi)，L5菌株產(chǎn)果膠酶的活性逐漸上升，在菌體穩(wěn)定期結(jié)束時(shí)酶活性達(dá)到最大值39940 U·min-1·mL-1;在76——80 h內(nèi)，果膠酶的活性下降。
圖3 L5菌株的生長(zhǎng)曲線
2.3 L5菌株的分類鑒定
2.3.1形態(tài)學(xué)鑒定
1）培養(yǎng)特征：PDA培養(yǎng)基上，28℃培養(yǎng)3 d即形成較典型的菌落，菌落中間呈藍(lán)綠色，邊緣為白色，直徑約19 mm,輪廓規(guī)則，外觀呈絨毛狀。
2）形態(tài)特征：28℃PDA培養(yǎng)基上培養(yǎng)3 d,顯微鏡下觀察L5菌株的菌絲形態(tài)、分生孢子梗的分枝情況、帚狀枝及瓶梗的類型等顯微形態(tài)特征。由圖2可見(jiàn)：菌絲細(xì)胞絲狀交織，具橫隔；分生孢子梗不具足細(xì)胞，帚狀枝為對(duì)稱雙輪型，瓶梗細(xì)長(zhǎng)漸變尖銳；分生孢子橢圓形，呈藍(lán)綠色。
2.3.2 ITS的PCR擴(kuò)增與序列分析
用真菌通用引物ITS1/ITS4對(duì)L5菌株進(jìn)行PCR擴(kuò)增，獲一長(zhǎng)度為572 bp的目的片段。將測(cè)序所得序列在美國(guó)國(guó)立生物技術(shù)信息中心（NCBI）進(jìn)行BLAST比對(duì)和同源性分析，結(jié)果表明L5菌株的ITS序列與Penicillium oxalicum同源性最高達(dá)99%.基于L5菌株的ITS序列建立的系統(tǒng)發(fā)育樹見(jiàn)圖4,結(jié)合形態(tài)特征鑒定，將L5菌株鑒定為草酸青霉菌（Penicillium oxalicum）。
圖4基于L5菌株的ITS序列建立的系統(tǒng)發(fā)育樹
3討論與結(jié)論
果膠酶的研究應(yīng)用迄今已有70多年的歷史，其用途廣泛，現(xiàn)階段產(chǎn)量已是世界四大酶制劑之一，而中國(guó)現(xiàn)有的生產(chǎn)果膠酶工藝存在著很多問(wèn)題，如固體發(fā)酵成本高、生產(chǎn)率低、易染菌等。面對(duì)國(guó)外果膠酶產(chǎn)品的優(yōu)勢(shì)，我國(guó)必須利用豐富的微生物資源，研究新的生產(chǎn)工藝，加緊篩選出擁有自主知識(shí)產(chǎn)權(quán)、低成本、無(wú)污染、滿足市場(chǎng)需求的商業(yè)化果膠酶。
本研究從污泥中篩選得到一株高產(chǎn)果膠酶的菌株，對(duì)其進(jìn)行了形態(tài)學(xué)鑒定，并對(duì)其進(jìn)行了ITS測(cè)序，確定其為草酸青霉菌。該菌的ITS序列基因已登錄GenBank,登錄號(hào)為：HQ680452.
本研究利用浙江來(lái)源豐富的桔皮和米糠作為搖瓶培養(yǎng)基材料，研究表明：該菌株在28℃，培養(yǎng)基初始pH 6.0,轉(zhuǎn)速160 r/min的條件下，培養(yǎng)70 h果膠酶活性最高，可達(dá)39940 U·min-1·mL-1;并且，該菌株利用成本低廉、天然、含果膠的植物材料為培養(yǎng)基，不僅實(shí)現(xiàn)了廢物再利用，也可以使其高產(chǎn)?？梢?jiàn)，對(duì)該菌株的研究具有潛在的意義，其應(yīng)用前景廣闊。
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