L-蘋果酸是生物體內(nèi)三羧酸循環(huán)的重要一員，在生物體中具有重要的生理功能［1］;同時也是天然果酸的重要組成部分，其酸味持久柔和，是優(yōu)良的酸味劑。因?yàn)樯鲜鎏匦裕琇-蘋果酸在醫(yī)藥、食品等多個行業(yè)中都有廣泛用途［2］。合成單一手性的L-蘋果酸主要方法有細(xì)胞/酶轉(zhuǎn)化法和微生物發(fā)酵法［3］，胡永紅等［4］以富馬酸鈣為底物，采用游離延胡索酸酶，直接轉(zhuǎn)化生成蘋果酸鈣，在40℃、pH 7.0～7.5的條件下，每升延胡索酸酶液能在20～28 h可將3.2 kg的富馬酸鈣轉(zhuǎn)化生成蘋果酸鈣，轉(zhuǎn)化率高達(dá)99.9%;周小燕等［5］使用L-蘋果酸高產(chǎn)突變株曲霉N1-14'在5 L罐上發(fā)酵120 h，L-蘋果酸產(chǎn)量達(dá)105.88 g/L，平均產(chǎn)生速率0.883 g/(L·h)，糖酸轉(zhuǎn)化率78.43%。
圖1野生大腸桿菌厭氧混合酸發(fā)酵途徑
大腸桿菌遺傳背景清楚、易于進(jìn)行代謝調(diào)控，操作簡便，在厭氧條件下進(jìn)行混合酸發(fā)酵(圖1)，可發(fā)酵糖生成甲酸、乙酸、乳酸、琥珀酸和乙醇等產(chǎn)物。通過代謝工程和基因敲除技術(shù)對大腸桿菌代謝途徑進(jìn)行改造，可消除副產(chǎn)物的積累，提高目的產(chǎn)物的產(chǎn)量。如Zhou等［6］和Jantama等［7］利用基于FLP/FRT重組酶系統(tǒng)的基因敲除技術(shù)對大腸桿菌的代謝途徑進(jìn)行改造，獲得生產(chǎn)不同物質(zhì)的重組大腸桿菌，其產(chǎn)物包括乙醇、丙酮酸、乳酸和琥珀酸等?；诖搜芯克悸?，在大腸桿菌中構(gòu)建L-蘋果酸的合成途徑，同時消除雜酸的影響，有可能獲得較高的產(chǎn)量與轉(zhuǎn)化率。
筆者以所在實(shí)驗(yàn)室前期構(gòu)建的產(chǎn)琥珀酸重組大腸桿菌E.coli B0013-1050［8］(敲除乙酸激酶、磷酸乙酰轉(zhuǎn)移酶基因ackA-pta、乳酸脫氫酶基因ldhA、丙酮酸甲酸裂解酶基因pflB、乙醇脫氫酶基因adhE和酶IICBGlc編碼基因ptsG)為出發(fā)菌株，利用Red同源重組結(jié)合Xer/dif重組技術(shù)［9－10］繼續(xù)敲除富馬酸酶基因和蘋果酸酶基因，構(gòu)建1條葡萄糖-PEP-草酰乙酸-L-蘋果酸的合成途徑，以實(shí)現(xiàn)L-蘋果酸在大腸桿菌中的積累。在此基礎(chǔ)上，通過克隆表達(dá)來源于黃曲霉的蘋果酸脫氫酶基因，強(qiáng)化合成途徑，進(jìn)一步提高L-蘋果酸的轉(zhuǎn)化率。
1、材料與方法
1.1材料與試劑
1.1.1菌株和質(zhì)粒
重組菌株E.coli 2010、E.coli 2020、E.coli 2030、E.coli 2040和重組菌E.coli B0013-1050由筆者所在實(shí)驗(yàn)室研究人員構(gòu)建。
質(zhì)粒:質(zhì)粒pSK-difGm和同源重組的協(xié)助質(zhì)粒pKD46、質(zhì)粒pNpheA保藏于筆者所在實(shí)驗(yàn)室;重組質(zhì)粒pMD18-T-fumB'::difGm、pMD18-T-fumC'::difGm、pMD18-T-maeB'::difGm、pUC19-pNmdh、pBR322-pNmdh和pTH18-pNmdh、pMD18-T-maeB'::difGm-pNmdh均為筆者所在研究課題組研究人員構(gòu)建。
1.1.2引物
本研究課題設(shè)計的引物(表1)均交由上海生工生物工程公司代為合成。
1.1.3工具酶和試劑
所用DNA限制性內(nèi)切酶EcoRI、BamHI、SmaI、HindIII和KpnI，Taq DNA聚合酶，反轉(zhuǎn)錄試劑盒均購自Fermentas公司;T4 DNA連接酶、pMD18-T simple vector、pfu高保真DNA聚合酶均為寶生生物工程有限公司產(chǎn)品;小量質(zhì)?？焖偬崛≡噭┖?、小量DNA片段純化回收試劑盒和小量DNA片段膠回收試劑盒為北京博大泰克生物基因技術(shù)有限責(zé)任公司產(chǎn)品;L-阿拉伯糖購自上海生工生物工程公司;酵母提取物和胰蛋白胨為Oxoid公司產(chǎn)品;其他試劑藥品均為國產(chǎn)分析純。
表1本研究中所用引物
1.1.4培養(yǎng)基
LB培養(yǎng)基(g/L):胰蛋白胨10，酵母浸出物5，NaCl 10。配制固體培養(yǎng)基時加入15 g/L瓊脂粉。
M9培養(yǎng)基(g/L):Na2HPO4·12H2O 15.12，KH2PO43.0，NaCl 0.5，NH4Cl 1.0。使用時需按體積分?jǐn)?shù)0.1%的量補(bǔ)加Mg2+(1 mol/L)和微量元素，并添加適量葡萄糖溶液作為C源。
微量元素(mmol/L):FeCl3·6H2O 8.88，CoCl2·6H2O 1.26，CuCl2·2H2O 0.88，ZnCl22.20，Na2MoO4·2H2O 1.24，H3BO31.21，MnCl2·4H2O 2.5。
抗生素:氨芐青霉素，終質(zhì)量濃度100μg/mL;慶大霉素，終質(zhì)量濃度30μg/mL;卡那霉素，終質(zhì)量濃度30μg/mL。
1.2方法
1.2.1目標(biāo)基因的敲除
利用Red同源重組結(jié)合Xer/dif重組技術(shù)依次敲除富馬酸酶基因fumB和fumC，蘋果酸酶基因sfcA和maeB。參照文獻(xiàn)［9］的基因敲除方法，依次構(gòu)建制備在dif-Gm-dif片段左右?guī)в心繕?biāo)基因上下游各200 bp左右同源臂的突變盒。將已經(jīng)導(dǎo)入質(zhì)粒pKD46的大腸桿菌目標(biāo)菌株在含氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)，加入L-阿拉伯糖誘導(dǎo)使其產(chǎn)生Red重組酶，制備感受態(tài)細(xì)胞，將同源重組片段與感受態(tài)細(xì)胞按適當(dāng)比例充分混合，電擊轉(zhuǎn)化并后培養(yǎng)1 h，涂布氨芐青霉素和慶大霉素的雙抗平板，30℃培養(yǎng)，挑選陽性轉(zhuǎn)化子。以驗(yàn)證引物對其進(jìn)行驗(yàn)證。將驗(yàn)證結(jié)果正確的菌株30℃下進(jìn)行傳代，使細(xì)胞內(nèi)Xer重組酶系統(tǒng)發(fā)揮作用自動識別dif位點(diǎn)，切除dif位點(diǎn)間的抗性基因，完成目的基因的敲除。
1.2.2發(fā)酵及產(chǎn)物檢測
搖瓶發(fā)酵:重組菌經(jīng)平板活化，挑取單菌落接入LB培養(yǎng)基中，37℃、200 r/min培養(yǎng)10～12 h，離心收集菌體，加入適量M9重懸，轉(zhuǎn)接M9培養(yǎng)基，葡萄糖初始質(zhì)量濃度5 g/L，37℃、200 r/min培養(yǎng)12 h。補(bǔ)加葡萄糖溶液至糖質(zhì)量濃度到30 g/L，以50 g/L的量加入CaCO3，塞上硅膠塞，轉(zhuǎn)入?yún)捬醢l(fā)酵，37℃、200 r/min發(fā)酵36 h。
15 L罐發(fā)酵:重組菌的活化和轉(zhuǎn)接與搖瓶發(fā)酵一致，M9中培養(yǎng)12 h后，作為發(fā)酵罐的種子液。發(fā)酵罐裝液量為6 L，接種量為5%，發(fā)酵溫度37℃，初始葡萄糖質(zhì)量濃度5 g/L，通氣量3 L/min，攪拌轉(zhuǎn)速200 r/min，好氧培養(yǎng)使菌體生長，適時調(diào)節(jié)攪拌轉(zhuǎn)速(200～500 r/min)使得溶解氧體積分?jǐn)?shù)大于30%，以NH3H2O控制pH為7。有氧培養(yǎng)至菌體濃度達(dá)到最大，停止通氣，攪拌速率降為100 r/min，進(jìn)入?yún)捬蹀D(zhuǎn)化階段。按6 g/L加入NaHCO3，并以2.4 mol/L K2CO3和1.2 mol/L KOH溶液代替NH3H2O控制pH為7，37℃恒溫厭氧發(fā)酵30 h。
產(chǎn)物檢測:葡萄糖濃度使用生物傳感分析儀(山東省科學(xué)院生物研究所)檢測;有機(jī)酸產(chǎn)量由高效液相色譜測定儀，泵為Dionex P680，紫外檢測器為Dionex UVD170U，色譜柱為反向C18色譜柱Nucleosil 100-5 C18，液相檢測條件參照文獻(xiàn)［11］。
1.2.3黃曲霉總RNA的提取及cDNA的制備
黃曲霉總RNA的提取方法參照文獻(xiàn)［12］，處理過后的總RNA按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒的說明進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄PCR，得到cDNA，用于蘋果酸脫氫酶基因mdh的PCR擴(kuò)增。
1.2.4黃曲霉蘋果酸脫氫酶基因mdh在重組菌中的表達(dá)
以質(zhì)粒pNpheA(含有組成型啟動子PN25)和黃曲霉cDNA為模版，通過重疊PCR擴(kuò)增得到帶有啟動子PN25的mdh基因，連接不同拷貝數(shù)載體質(zhì)粒(pUC19、pBR322和pTH18)，構(gòu)建重組質(zhì)粒pUC19-pNmdh、pBR322-pNmdh和pTH18-pNmdh，并導(dǎo)入重組菌中進(jìn)行表達(dá)。
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