深色有隔內(nèi)生真菌（Dark Septate Endophytes，DSE）可以廣泛定殖于植物根系，促進植物生長及養(yǎng)分吸收。然而，其代謝物作為植物生物刺激素的研究卻較少受到關(guān)注。本研究通過分析鏈格孢菌（Alternaria sp.）的生長曲線及其胞外代謝物組分，探討了DSE胞外代謝物對紫花苜蓿的促生作用，并對其生長特性進行了初步研究。結(jié)果顯示，鏈格孢菌在1-8 d處于生長期，8-16 d進入穩(wěn)定期。不同生長階段的胞外代謝物組分存在顯著差異。研究表明，添加DSE胞外代謝物可顯著提高紫花苜蓿的生物量（P<0.05）。與對照組相比，DSE在生長8 d時表現(xiàn)出更高的生物量和養(yǎng)分利用率。進一步分析發(fā)現(xiàn)，毛蕊異黃酮7-半乳糖苷、1-[(5-氨基-5-羧基戊基)氨基]1-脫氧果糖、N2-果吡喃糖基精氨酸、己酸2-(4-甲基-5-噻唑基)乙酯、肯普苷B以及麥迪諾苷E6等化合物與紫花苜蓿生物量呈極顯著正相關(guān)（P<0.01）。本研究將DSE胞外代謝物與植物及土壤性狀相結(jié)合，為開發(fā)基于DSE胞外代謝物的植物生物刺激素提供了理論依據(jù)。
圖1試驗流程圖
主要研究結(jié)果
1.DSE的生長特性：與DSE在MMN培養(yǎng)基生長過程中，發(fā)生明顯的顏色變化。隨培養(yǎng)時間的增加，DSE菌液逐漸從淺褐色（4 d）變成深褐色（8、12 d），直至黑色（16、20 d）。根據(jù)不同培養(yǎng)時間DSE生物量的變化，繪制出DSE的生長曲線。0-8 d，DSE一直處于生長期。4-8 d，DSE生長速度加快。從8 d開始，DSE生物量增長速度減緩，進入穩(wěn)定期。DSE生長12 d，DSE生物量基本達到峰值。DSE培養(yǎng)16 d后，DSE生物量開始緩慢下降，進入衰亡期。
圖2 DSE不同培養(yǎng)時間的顏色變化(a)，及其生長曲線(b)
2.DSE胞外代謝物組分類型的相關(guān)變化：用非靶向代謝組學(xué)技術(shù)對不同培養(yǎng)時間的DSE胞外代謝物進行分析，共篩選鑒定得到差異代謝物137個。由韋恩圖可知，所有潛伏期共有95種代謝物。8和12 d不存在特定的代謝物，4、16和20 d分別存在不同于其他時期的代謝物有16、1和12種。胞外代謝物包括氨基酸，肽和類似物、有機氧化合物、脂質(zhì)和類脂分子、有機雜環(huán)化合物、苯丙烷和聚酮化合物、核苷，核苷酸和類似物、苯甲酸化合物、有機硫化合物、生物堿及其衍生物、有機氮化合物和有機酸及其衍生物11種化合物。不同培養(yǎng)時間的DSE胞外代謝物種類占比相似。其中，氨基酸，肽和類似物、有機氧化合物、脂質(zhì)和類脂分子、有機雜環(huán)化合物和苯丙烷和聚酮化合物占總化合物的90%左右。
圖3不同培養(yǎng)時期DSE胞外差異代謝物占比
3.生物刺激素關(guān)鍵物質(zhì)的篩選：通過相關(guān)性分析，篩選出具有極顯著（P<0.01）正相關(guān)的6種化合物：毛蕊異黃酮-7-半乳糖苷，1-[(5-氨基-5-羧基戊基)氨基]-1-脫氧果糖，N2-果吡喃糖基精氨酸，己酸-2-(4-甲基-5-噻唑基)乙酯，肯普苷B，麥迪諾苷E6。這6種化合物在培養(yǎng)8 d的DSE胞外代謝物中相對含量占比分別是5.6%，2.0%，1.5%，1.0%，0.6%，0.1%。
圖4毛蕊異黃酮-7-半乳糖苷（a），1-[(5-氨基-5-羧基戊基)氨基]-1-脫氧果糖（b），N2-果吡喃糖基精氨酸（c），己酸-2-(4-甲基-5-噻唑基)乙酯（d），肯普苷B（e），麥迪諾苷E6（f）與紫花苜蓿生物量的線性回歸關(guān)系PART.4
結(jié)論與展望
時間因素顯著影響DSE生長和胞外代謝物組分變化。不同生長時間的DSE胞外代謝物組分具有顯著差異。通過對DSE胞外代謝物組分進行LC-MS分析，共鑒定出137種化合物。以氨基酸，肽類化合物為主。在紫花苜蓿根際添加DSE胞外代謝物，可以促進紫花苜蓿生長和養(yǎng)分吸收。在盆栽條件下，添加培養(yǎng)8 d的DSE胞外代謝物對紫花苜蓿促生效果最明顯，顯著提高紫花苜蓿生物量、養(yǎng)分含量和養(yǎng)分利用率。基于非靶向代謝組學(xué)技術(shù)結(jié)合植物和土壤參數(shù)分析，推測DSE胞外代謝物主要通過直接被植物作為養(yǎng)分吸收，化學(xué)信號調(diào)節(jié)植物的養(yǎng)分吸收過程，刺激植物根系提高植物養(yǎng)分吸收能力，刺激植物根系分泌更多的酶活化土壤養(yǎng)分四種途徑對植物產(chǎn)生促生作用。本研究表明DSE胞外代謝物可以作為植物生物刺激劑，但接下來仍需要充分了解其所含的組分對植物產(chǎn)生的養(yǎng)分吸收的分子調(diào)控，并對其進行野外更貼合實際環(huán)境的復(fù)雜因素下的研究。
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