金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）是一種引起人和動(dòng)物感染的重要致病菌，能夠引起皮膚、肺等局部感染以及敗血癥、膿毒癥等全身性感染性疾病，嚴(yán)重可致死亡，威脅著人類和動(dòng)物健康。
盡管目前研究表明PVL在金黃色葡萄球菌致病性中發(fā)揮著重要作用，但該毒力因子具體的致病機(jī)理還不十分明確，本實(shí)驗(yàn)以金黃色葡萄球菌ATCC 49775株為研究對(duì)象，利用同源重組的方法構(gòu)建PVL基因敲除菌株，并對(duì)敲除菌株的穩(wěn)定性和生長特性進(jìn)行評(píng)價(jià)，為進(jìn)一步闡明金黃色葡萄球菌PVL的致病機(jī)理奠定基礎(chǔ)。
實(shí)驗(yàn)內(nèi)容
敲除菌株和回補(bǔ)菌株體外生長曲線的測定
將敲除菌株ΔPVL、回補(bǔ)菌株CΔPVL與金黃色葡萄球菌ATCC 49775 37℃在TSB液體培養(yǎng)基中，37℃220 r/min培養(yǎng)，每隔30 min取200μL菌液測定一次OD600nm值，試驗(yàn)重復(fù)3次，繪制3種菌株的生長曲線。
實(shí)驗(yàn)結(jié)果
圖1敲除菌株ΔPVL、回補(bǔ)菌株CΔPVL與金黃色葡萄球菌ATCC 49775生長速率的比較
在相同條件下分別培養(yǎng)敲除菌株ΔPVL、回補(bǔ)菌株CΔPVL與金黃色葡萄球菌ATCC 49775（WT），根據(jù)OD600nm值繪制生長曲線。結(jié)果顯示，ΔPVL在體外生長較慢并且其生長速率顯著低于ATCC 49775野生菌，在培養(yǎng)2 h～4.5 h生長速率差異顯著，CΔPVL在體外生長速率與ATCC 49775野生菌基本一致（圖1）（p<0.01）。表明，PVL基因的缺失可能影響了金黃色葡萄球菌ATCC 49775的生長速率，推測PVL的合成與金黃色葡萄球菌的生長性能相關(guān)。
討論
PVL由LukS-PV和LukF-PV這兩個(gè)共轉(zhuǎn)錄基因組成，其首次在金黃色葡萄球菌ATCC 49775中被發(fā)現(xiàn)，是一種對(duì)人類和兔子多核型白細(xì)胞具有高度特異性的白細(xì)胞素[8]。PVL作為金黃色葡萄球菌的毒力因子，在金黃色葡萄球菌中并不常見，因此對(duì)于PVL的潛在威脅知之甚少[4]。目前已有研究報(bào)道PVL與原發(fā)性皮膚感染和肺炎有關(guān)[3]，并且對(duì)其在皮膚、大腦、呼吸系統(tǒng)和肌肉骨骼等器官或系統(tǒng)的研究結(jié)果顯示，PVL逐漸成為一種新的全球公共衛(wèi)生威脅[9-11]。
在對(duì)病原微生物的研究中，靶基因的置換或缺失是確定該基因功能、闡明其致病機(jī)理的重要手段[12]。目前，利用同源重組的方法對(duì)目標(biāo)基因敲除是研究細(xì)菌單基因功能的常用方法，在革蘭氏陰性菌中廣泛應(yīng)用。
本研究分別以溫敏型質(zhì)粒pBT2和穿梭質(zhì)粒pLI50為載體，利用同源重組的方法構(gòu)建了金黃色葡萄球菌ATCC 49775 PVL的基因敲除菌株和該基因的回補(bǔ)菌株。在構(gòu)建的敲除質(zhì)粒中引入ermB基因作為抗性篩選標(biāo)記，使其具有紅霉素抗性，同源重組后一方面將紅霉素抗性基因引入ATCC 49775野生菌株中，使重組菌株獲得紅霉素抗性，進(jìn)而利用紅霉素篩選陽性重組菌；另一方面，ermB基因整合替換了野生菌株中的PVL基因，進(jìn)而完成了對(duì)PVL基因的敲除。
此外，通過對(duì)敲除菌株ΔPVL和回補(bǔ)菌株CΔPVL體外生長特性的測定表明ΔPVL與野生型ATCC 49775菌株相比生長速率顯著下降，回補(bǔ)菌株CΔPVL與野生型ATCC 49775菌株生長速率基本一致，目前還無PVL基因與金黃色葡萄球菌的生長代謝相關(guān)的研究報(bào)道。本研究表明，PVL基因可能與金黃色葡萄球菌的生長調(diào)節(jié)有關(guān)，具體機(jī)制還需要進(jìn)一步研究。
本研究構(gòu)建的金黃色葡萄球菌ATCC 49775的敲除菌株，為進(jìn)一步研究PVL基因的功能及其在金黃色葡萄球菌感染中的致病機(jī)理奠定了基礎(chǔ)。
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