采用4種不同濃度的抗生素對(duì)(氨芐青霉素(Amp)、卡那霉素(Kan)、氯霉素(Cmp)及四環(huán)素(Tet))萊茵衣藻(Chlamydomonasreinhardtii)進(jìn)行無菌化處理，研究抗生素種類及濃度對(duì)萊茵衣藻的細(xì)胞密度、葉綠素a含量及光化學(xué)活性的影響，以確定對(duì)萊茵衣藻細(xì)胞無害并能抑制伴雜菌生長的抗生素種類及使用濃度。結(jié)果表明：低于100μg/mL的氨芐青霉素(Amp)及20μg/mL的氯霉素(Cmp)處理，會(huì)使萊茵衣藻的細(xì)胞密度及葉綠素a的含量增加，卡那霉素(Kan)及四環(huán)素(Tet)各濃度的處理都會(huì)使細(xì)胞密度及葉綠素a的含量下降，并呈現(xiàn)抗生素的劑量依賴效應(yīng)；50μg/mL的Amp及10μg/mL的Cmp在處理3 d后會(huì)增加萊茵衣藻的實(shí)際光合效率(YII)及相對(duì)電子傳遞效率(rETR)，而后下降；Kan及Tet各濃度的處理都會(huì)使YII及rETR顯著下降。結(jié)合4種抗生素對(duì)萊茵衣藻伴生菌的抑菌實(shí)驗(yàn)結(jié)果，表明在4種抗生素中，Cmp在抑菌范圍內(nèi)并不會(huì)明顯地抑制萊茵衣藻細(xì)胞的生長與光化學(xué)活性，可用于萊茵衣藻細(xì)胞無菌化培養(yǎng)中。
萊茵衣藻(Chlamydomonasreinhardtii)隸屬于綠藻門、團(tuán)藻目、衣藻屬，為低等的具鞭毛單細(xì)胞水生植物，廣泛分布在海洋、江河、湖泊等水域，通過光合作用獲得能量，也可以在有碳源的完全黑暗的環(huán)境中生長。高度的適應(yīng)性、快速的傳代能力及其至關(guān)重要的代謝途徑使得萊茵衣藻成為生物學(xué)研究領(lǐng)域的模式生物，常被用作研究真核生物鞭毛的組裝、基體功能及功能障礙等病理效應(yīng)的模型。萊茵衣藻所含有的核、葉綠體及線粒體三套基因組，目前均已完成了測序，極大地促進(jìn)了藻類代謝、葉綠體生物起源、光合作用機(jī)制、營養(yǎng)元素脅迫以及產(chǎn)氫等方面的研究。
微藻的無菌培養(yǎng)和保存是研究微藻生理、生化、營養(yǎng)、藥理學(xué)及毒理學(xué)等必不可少的步驟之一，也是基礎(chǔ)和關(guān)鍵環(huán)節(jié)。在微藻培養(yǎng)過程中，由于藻種常伴有雜藻或雜菌，而無法準(zhǔn)確進(jìn)行藻間或藻菌相互作用、兼養(yǎng)和異養(yǎng)等方面的研究?？股乜梢种扑?xì)菌的繁殖，在除菌、抑菌方面表現(xiàn)出了強(qiáng)大作用，利用微藻比雜菌具有對(duì)抗生素更強(qiáng)的耐受性，選擇使用一種或多種抗生素進(jìn)行無菌處理則較容易獲得無菌藻系。如孫雯等采用了8種常用抗生素對(duì)雨生紅球藻(Haematococcuspluvialis)進(jìn)行無菌化處理，結(jié)果表明：在培養(yǎng)前期加入灰黃霉素的抑菌效果最好，且對(duì)雨生紅球藻細(xì)胞的生長抑制最??；培養(yǎng)中后期添加青霉素的抑菌效果較明顯；混合使用灰黃霉素和青霉素時(shí)抑菌效果明顯優(yōu)于使用單一抗生素。目前，國內(nèi)外有關(guān)微藻無菌化培養(yǎng)及對(duì)抗生素敏感性研究的報(bào)道相對(duì)較少，主要集中在綠藻、顫藻、螺旋藻及紫球藻等方面。
本研究中，筆者根據(jù)抗生素在抗菌機(jī)制和抗菌譜上的差別，選擇了常用的4種抗生素，氨芐青霉素(ampicillin，Amp)、卡那霉素(kanamycin，Kan)、氯霉素(chloramphenicol，Cmp)及四環(huán)素(tetracycline，Tet)應(yīng)用于萊茵衣藻的培養(yǎng)中，通過生長曲線、葉綠素a含量、光化學(xué)活性等指標(biāo)來探究每種抗生素的存在濃度與萊茵衣藻的生長和光化學(xué)活性之間的聯(lián)系，確定分離及純化萊茵衣藻時(shí)對(duì)藻細(xì)胞無害、同時(shí)又能抑制伴生雜菌生長的抗生素種類及濃度，以期為萊茵衣藻無菌系的建立提供理論支持。
1材料與方法
1.1藻種及培養(yǎng)
萊茵衣藻(C.reinhardtii)購自中國科學(xué)院野生生物種質(zhì)庫，使用TAP(tris acetate phosphate)液體培養(yǎng)基，其成分按文獻(xiàn)配制，培養(yǎng)溫度為(25±1)℃，光照強(qiáng)度為60μmol/(m·s)，光暗時(shí)間比為12∶12。培養(yǎng)過程中每天搖動(dòng)培養(yǎng)瓶數(shù)次，防止微藻附壁下沉，待進(jìn)入指數(shù)生長期時(shí)，將其按5×105個(gè)/mL的密度接種后，用抗生素處理，然后測定分析微藻的相關(guān)生理指標(biāo)。在藻種傳代培養(yǎng)過程中，嚴(yán)格按照無菌操作規(guī)程進(jìn)行，細(xì)菌培養(yǎng)使用LB固體培養(yǎng)基。
1.2實(shí)驗(yàn)方法
1.2.1藻細(xì)胞密度測定
將4種抗生素分別加入到處于指數(shù)生長期的萊茵衣藻藻液中，各抗生素的終濃度分別設(shè)定4個(gè)梯度(表1)，以未加入抗生素的藻液作為對(duì)照組。采用血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)，每天定時(shí)吸取少量搖勻的藻液，置于視野為40×10倍的光學(xué)顯微鏡下觀察，記錄藻細(xì)胞總數(shù)。
表1 4種抗生素的質(zhì)量濃度
1.2.2葉綠素a含量的測定
4種不同濃度的抗生素處理指數(shù)生長期的藻液時(shí)，每天每個(gè)處理組各取5 mL的藻液，以6 000 r/min離心10 min，去除上清液后，將藻細(xì)胞用90%丙酮在黑暗條件下提取2次，每次24 h，最后將提取液定容至10 mL，使用紫外分光光度計(jì)在750、663、645和630 nm下測定吸光度。
1.2.3葉綠素?zé)晒鈪?shù)的測定
利用多激發(fā)波長調(diào)制葉綠素?zé)晒鈨x(德國，Walz)測定藻細(xì)胞的光化學(xué)活性。不同種類及濃度的抗生素處理后，每天取樣，測定熒光參數(shù)。檢測過程如下：首先將處于指數(shù)生長期的萊茵衣藻培養(yǎng)液黑暗處理12 h，然后取2 mL藻液加入石英杯中，設(shè)置檢測光(measure light，ML)波長為440 nm，并將實(shí)時(shí)熒光(current fluorescence level)Ft調(diào)至1.5，運(yùn)行腳本sigma 500 chl并進(jìn)行O-I1擬合，保存萊茵衣藻光學(xué)截面積數(shù)據(jù)，在sp-analysis模式下進(jìn)行快速光曲線測定，將保存的光學(xué)截面積數(shù)據(jù)應(yīng)用于快速光曲線，最后在view-mode模式下，記錄葉綠素?zé)晒獾某跏贾?F0)及最大值(Fm)、實(shí)際光量子產(chǎn)額(YII)及相對(duì)電子傳遞效率(rETR)。
1.3抗生素對(duì)萊茵衣藻伴生細(xì)菌的抑制作用
采取平板涂布結(jié)合取樣鏡檢的方法，對(duì)經(jīng)抗生素處理7 d后的藻液中存在的細(xì)菌數(shù)目進(jìn)行檢驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)中，將處理組和對(duì)照組藻液用TAP液體培養(yǎng)基稀釋100倍后，涂布在LB固體培養(yǎng)基平板上，37℃培養(yǎng)溫箱中過夜培養(yǎng)24 h以上，直至長出菌落為止，根據(jù)單菌落的數(shù)目確定藻液中細(xì)菌的密度。
1.4數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析
各實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組均設(shè)置3個(gè)平行處理，取平均值(Mean±SD)。以T檢驗(yàn)比較對(duì)照組與實(shí)驗(yàn)組之間的差異顯著性，P<0.05表示差異顯著，P<0.01表示差異極顯著。
相關(guān)新聞推薦
1、江米酒曲中高產(chǎn)凝乳酶菌篩選、生長曲線及凝乳活力及蛋白水解活力測定（四）