摘要采用盆栽試驗，研究添加葡萄枝條對葡萄樹體生長及真菌結(jié)構(gòu)的影響，評價修剪葡萄枝條循環(huán)再利用的可行性。以一年生“陽光玫瑰”葡萄為試材，分別添加不同比例的葡萄枝條，測定植株新梢長、新梢粗、葉面積、根系總體積等的變化，同時利用高通量測序技術(shù)研究土壤真菌群落結(jié)構(gòu)的變化。門水平上，擔(dān)子菌門（Basidiomycota）和子囊菌門（Ascomycota）為優(yōu)勢類群。添加枝條處理降低了60，120，150 d時鏈格孢屬（Alternaria）、光黑殼屬（Preussia）、枝頂孢屬（Acremonium）、絲葚霉屬（Papulaspora）、新赤殼屬（Neocosmospora）、平臍蠕孢屬（Bipolaris）、毛殼屬（Chaetomium）、無莖真菌屬（Acaulium）、枝孢屬（Cladosporium）和間座殼屬（Diaporthe）的相對豐度。T2處理還降低了整個處理過程中葡萄穗霉屬（Stachybotrys）、Acrocalymma、Albifimbria、Gibellulopsis和曲霉屬（Aspergillus）等的相對豐度，并提高了60，90，150 d時小脆柄菇屬（Psathyrella）的相對豐度。添加適宜比例的葡萄枝條能夠提高葡萄新梢長和根系總體積。T2處理后150 d時新梢長是對照的1.2倍。總之，適量添加葡萄枝條優(yōu)化了土壤真菌群落結(jié)構(gòu)，有利于木質(zhì)素的降解，并形成對病原真菌抑制作用的土壤，降低葡萄感染病害的風(fēng)險，T2處理在改善土壤真菌群落結(jié)構(gòu)及促進(jìn)樹體生長方面綜合表現(xiàn)最好。
在過去的幾十年中，為了提高農(nóng)作物產(chǎn)量，在耕地上大量使用化肥、開展集約化生產(chǎn)以及增加負(fù)載量，這加速了對土壤的開發(fā)利用，導(dǎo)致土壤有機(jī)質(zhì)減少，顯著改變了土壤微生物群落結(jié)構(gòu)，造成土壤中原有有機(jī)碳損耗，與此同時，修剪等形成的廢棄植物殘體的清理，導(dǎo)致果園土壤返還的碳量較少。從長遠(yuǎn)來看，這些因素將會導(dǎo)致土壤退化，引起作物產(chǎn)量降低。如果能合理利用這些修剪廢棄物產(chǎn)生的有機(jī)碳源，將有助于緩解土壤有機(jī)碳損失。因此，生產(chǎn)中應(yīng)該采取適當(dāng)?shù)霓r(nóng)藝措施，優(yōu)化土壤微生物群落結(jié)構(gòu)，提高土壤有機(jī)質(zhì)含量。
土壤微生物參與土壤養(yǎng)分循環(huán)、有機(jī)碳的礦化固定，對土壤有機(jī)質(zhì)和土壤團(tuán)粒結(jié)構(gòu)的形成具有直接作用，其群落結(jié)構(gòu)在維持土壤生態(tài)系統(tǒng)功能上具有重要意義，并最終影響植物的生長。植物殘體（修剪枝條、秸稈等）還田與土壤微生物之間是相互促進(jìn)的關(guān)系。植物殘體作為有機(jī)改良劑對土壤微生物群落結(jié)構(gòu)具有一定的重塑作用，能夠改變土壤活性有機(jī)碳組分，增加微生物生物量，促進(jìn)土壤微生物活性的提高和養(yǎng)分循環(huán)，進(jìn)而提高土壤的肥力水平。反之，土壤微生物又參與植物殘體的降解過程。土壤真菌在碳源轉(zhuǎn)化過程中發(fā)揮關(guān)鍵作用，可推動外源有機(jī)物的分解和腐殖化過程。
每年葡萄樹修剪都會產(chǎn)生大量廢棄枝條，這些枝條中含有豐富的有機(jī)質(zhì)以及各種無機(jī)養(yǎng)分。然而，這些廢棄枝條常常被當(dāng)作燃料直接燃燒，這樣不但會造成養(yǎng)分的浪費，而且燃燒過程中會產(chǎn)生致癌污染物。美國、澳大利亞、新西蘭等國家使用葡萄枝條堆肥覆蓋葡萄園，可以有效提高果實產(chǎn)量，降低果實含酸量，并提高果實鉀元素的含量。研究指出，在葡萄園中使用葡萄修剪廢料堆肥可以對土壤肥力、根系生長、產(chǎn)量和葡萄品質(zhì)產(chǎn)生有益的影響。因此，如何對葡萄等果樹廢棄枝條進(jìn)行合理化利用是目前生產(chǎn)中較為關(guān)注的問題。
葡萄枝條木質(zhì)化嚴(yán)重，較難降解。自然界中真菌、細(xì)菌和放線菌均是降解木質(zhì)素的微生物。其中，真菌可通過分泌胞外酶來完成降解，且降解能力最強(qiáng)。真菌介導(dǎo)的木質(zhì)素降解主要引起側(cè)鏈氧化、去甲基化/去甲氧基化、芳香環(huán)斷裂等過程。然而，關(guān)于植物殘體還田的研究主要集中于秸稈還田，針對葡萄等木質(zhì)化枝條還田對土壤微生態(tài)，尤其是對真菌群落結(jié)構(gòu)影響的研究較少。不同植物殘體還田對土壤微生態(tài)環(huán)境的影響不同，而這些差異被認(rèn)為是由植物組織、碎屑數(shù)量和質(zhì)量差異引起的。同樣得出，植物材料差異會影響土壤中碳源和養(yǎng)分循環(huán)的結(jié)論。添加的碳源從降解功能上對土壤微生物群落結(jié)構(gòu)作出改變。因此，有必要對添加葡萄枝條后葡萄根域土壤微生物群落結(jié)構(gòu)變化特征進(jìn)行研究。
本試驗以一年生盆栽“陽光玫瑰”葡萄為試材，設(shè)計添加不同比例葡萄枝條處理，研究添加葡萄枝條對葡萄新梢生長、根系發(fā)育及土壤真菌群落結(jié)構(gòu)等的影響，以期確定合適的葡萄枝條添加劑量。這既能為葡萄廢棄枝條處理提供一種可供選擇的方案，又能為葡萄枝條還田后土壤微生態(tài)變化提供理論依據(jù)。
1材料與方法
1.1材料與處理
試驗于2019年3月至8月在天津農(nóng)科院現(xiàn)代農(nóng)業(yè)科技創(chuàng)新基地（北緯39°43'，東經(jīng)116°96'）日光溫室完成。采用上海余昌園林工程有限公司生產(chǎn)的新60型銀杏牌枝條粉碎機(jī)（38.5 kW/380 V，700 mm×1 400 mm×1 300 mm）對一年生健康葡萄枝條進(jìn)行粉碎。枝條粉碎后長為0.5~1.0 cm。為保證定植用栽培園土能夠真實準(zhǔn)確反映陽光玫瑰葡萄根域土壤微生物代謝特征，這部分土壤取自園區(qū)內(nèi)陽光玫瑰葡萄地塊土壤，清除該地塊凋落物、石塊和葡萄根系等雜質(zhì)，混勻過篩備用。
栽培園土基本理化性質(zhì)：速效氮40.95 mg/kg，速效磷32.06 mg/kg，速效鉀124.79 mg/kg，pH 7.35。將栽培園土與粉碎的葡萄枝條按照質(zhì)量比為100∶1（T1），50∶1（T2），30∶1（T3），20∶1（T4）和10∶1（T5）的比例混合均勻，作為試驗盆栽基質(zhì)，以園土栽培為對照（ck）。以一年生“陽光玫瑰”葡萄苗為試材，2019年3月選擇長勢一致、無病蟲害的優(yōu)質(zhì)苗木定植于裝有上述混合基質(zhì)的15 L營養(yǎng)缽內(nèi)（上口徑30 cm，高度30 cm，底徑20 cm），常規(guī)管理。試驗包含6個處理，每個處理48株，共計288株苗木。分別于苗木定植后60，90，120，150 d收獲，用于各項指標(biāo)的檢測。每個取樣時期每個處理隨機(jī)收獲12株，每4株為1次重復(fù)，共3次重復(fù)。
1.2土壤取樣方法
每個取樣時期將每個處理的12株苗木隨機(jī)分成3組（即3次重復(fù)），每組4株苗木，將每組的4株苗木去掉營養(yǎng)缽、松動土壤，然后去除根系、凋落物等雜質(zhì)，過1 mm篩后充分混勻，作為一個土壤樣品重復(fù)（共計3次生物學(xué)重復(fù)）。每個生物學(xué)重復(fù)再按照四分法取樣分成3份，分別用于不同指標(biāo)檢測。其中，2份用冰盒迅速帶回實驗室并保存在-80℃或4℃，用于土壤高通量測序及土壤酶活性分析，1份自然風(fēng)干、研磨過篩后，用于土壤基本理化性質(zhì)檢測。
1.3研究方法
采用CTAB法提取土壤樣品基因組DNA，委托北京諾禾致源科技股份有限公司完成測序。對真菌ITS1區(qū)（Internal Transcribed Spacer1）進(jìn)行PCR引物擴(kuò)增。使用帶Barcode的特異引物，New England Biolabs公司的Phusion®High-Fidelity PCR Master Mix with GC Buffer和高效高保真酶進(jìn)行PCR。擴(kuò)增引物為ITS1-1F-F（5'-CTTGGTCA TTTAGAGGAAGTAA-3'）和ITS1-1F-R（5'-GCT GCGTTCTTCATCGATGC-3'）。PCR產(chǎn)物使用2%的瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳檢測，對目的條帶采用Qiagen Gel Extraction Kit（Qiagen，Germany）進(jìn)行回收。使用TruSeq®DNA PCR-Free Sample Preparation Kit進(jìn)行文庫構(gòu)建，經(jīng)過Qubit和Q-PCR定量后使用NovaSeq6000上機(jī)測序。下機(jī)數(shù)據(jù)截去Barcode和引物序列，采用FLASH（V1.2.7）拼接，利用Qiime（V1.9.1）質(zhì)量過濾器過濾合并序列。通過UCHIME Algorithm與物種注釋數(shù)據(jù)庫比對，去除嵌合體序列獲得最終有效數(shù)據(jù)。利用Uparse軟件（Uparse v7.0.1001）對上述最終有效數(shù)據(jù)進(jìn)行聚類，按照97%的相似度將序列聚類成為OTUs（Operational taxonomic units）。最后，采用Mothur方法與SILVA132的SSUrRNA數(shù)據(jù)庫進(jìn)行物種注釋分析。每個土壤樣品3次生物學(xué)重復(fù)。
1.4數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析
所得數(shù)據(jù)采用IBM SPSS Statistics數(shù)據(jù)處理軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析。本試驗采用單因素完全隨機(jī)試驗設(shè)計。其中顯著性分析采用Duncan's多重比較法（P<0.05）。利用R軟件（Version 2.15.3）繪制稀釋曲線、Venn圖、群落柱形圖和真菌屬水平相對豐度Heatmap圖，并進(jìn)行主坐標(biāo)分析（PCoA）。使用Microsoft Excel軟件繪制柱形圖。圖表中數(shù)據(jù)均為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差。
葡萄枝條處理對土壤真菌群落結(jié)構(gòu)、生態(tài)變化的影響（一）
葡萄枝條處理對土壤真菌群落結(jié)構(gòu)、生態(tài)變化的影響（二）
葡萄枝條處理對土壤真菌群落結(jié)構(gòu)、生態(tài)變化的影響（三）
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