2.3解淀粉芽孢桿菌GSBa-1的生長(zhǎng)和產(chǎn)酶活力曲線圖
圖4解淀粉芽孢桿菌GSBa-1生長(zhǎng)（A）和產(chǎn)酶活力（B）曲線
由圖4A可知，OD600nm值顯示菌株LB-51在液體培養(yǎng)基中0～4 h生長(zhǎng)速率緩慢，菌體生物量幾乎不增加，處于遲緩期；在4～12 h時(shí)生長(zhǎng)速率最快，菌體細(xì)胞以幾何級(jí)數(shù)速率分裂，處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期；在12～24 h時(shí)菌體量隨時(shí)間變化不大，基本保持平衡，處于穩(wěn)定期；24 h以后菌體量迅速減少，菌體死亡速率超過新生的速率，處于衰亡期，一般是由于營養(yǎng)成分不足和后期代謝產(chǎn)物的增加導(dǎo)致環(huán)境變化引起的。由圖4B可知，菌株GSBa-1產(chǎn)凝乳酶在其對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期內(nèi)產(chǎn)量很少，隨著發(fā)酵時(shí)間延長(zhǎng)，產(chǎn)酶量也逐漸增加，在24～60 h之間產(chǎn)酶增加量不明顯；但隨著時(shí)間繼續(xù)延長(zhǎng)，產(chǎn)酶活力明顯提高，在72 h時(shí)達(dá)到最大值，凝乳活力為（431.53±15.89）SU/mL，同時(shí)蛋白水解活力為（5.05±0.59）U/mL；之后酶活力逐漸降低，蛋白水解活力與凝乳活力變化趨勢(shì)基本相同。
2.4解淀粉芽孢桿菌GSBa-1凝乳酶的凝乳活性評(píng)價(jià)
圖5解淀粉芽孢桿菌GSBa-1凝乳酶、凝乳反應(yīng)和乳清析出
由圖5A可知，菌株GSBa-1凝乳酶粗酶為淺灰色，蓬松棉絮狀。由圖5B可知，相同的酶質(zhì)量濃度條件下，GSBa-1凝乳酶比商業(yè)酶凝乳反應(yīng)時(shí)間稍長(zhǎng)，凝塊結(jié)實(shí)且富有彈性。由圖5C可知，凝塊收縮且都伴有乳清析出現(xiàn)象，和商業(yè)酶相比，菌株GSBa-1凝乳酶乳清析出反應(yīng)不明顯。在凝乳反應(yīng)中，2 mg/mL GSBa-1凝乳酶液凝乳時(shí)間為78 s，即凝乳活力為307.69 SU/mL，菌株GSBa-1粗酶單位酶活力為1.54×105SU/g；相同質(zhì)量濃度條件下商業(yè)凝乳酶凝乳時(shí)間為36 s，單位酶活力為3.16×105SU/g。
3討論與結(jié)論
從傳統(tǒng)安全食品宮廷奶酪的凝乳劑（江米酒酒曲）中分離篩選產(chǎn)凝乳酶的優(yōu)良菌株對(duì)發(fā)掘傳統(tǒng)飲食文化遺產(chǎn)、豐富產(chǎn)凝乳酶微生物菌源和緩解干酪加工所需凝乳酶緊張的供應(yīng)狀態(tài)有著重要的理論和實(shí)踐意義。國內(nèi)已初步開展了酒曲中產(chǎn)凝乳酶微生物的分離篩選。劉振民等采用酒藥作為分離源，篩選出高產(chǎn)凝乳酶霉菌菌株M10，并對(duì)該菌發(fā)酵產(chǎn)酶條件進(jìn)行了優(yōu)化研究。滕國新等對(duì)酒曲中產(chǎn)凝乳酶微生物進(jìn)行了分離純化研究，結(jié)果表明根霉菌為酒曲中產(chǎn)凝乳酶優(yōu)勢(shì)菌。程巧玲等從酒曲中篩選得到一株霉菌、一株酵母菌和兩株細(xì)菌，并確定霉菌為產(chǎn)凝乳酶優(yōu)勢(shì)菌。本實(shí)驗(yàn)借鑒前人的研究經(jīng)驗(yàn)，通過對(duì)酒曲中微生物的分離純化，共得到11株細(xì)菌和2株真菌；采用酪蛋白平板法初篩和不同液體培養(yǎng)基發(fā)酵復(fù)篩出一株產(chǎn)凝乳酶優(yōu)勢(shì)菌株LB-51。根據(jù)形態(tài)學(xué)觀察、生理生化實(shí)驗(yàn)和16S rDNA分子生物學(xué)鑒定該菌株為解淀粉芽孢桿菌，并命名為解淀粉芽孢桿菌GSBa-1。此實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明酒曲中存在高產(chǎn)凝乳酶細(xì)菌菌株，與前人報(bào)道的霉菌是產(chǎn)凝乳酶優(yōu)勢(shì)菌株不一致，這可能與酒曲來源及種類有關(guān)。
液體LB培養(yǎng)基作為實(shí)驗(yàn)菌株GSBa-1適宜的發(fā)酵產(chǎn)凝乳酶培養(yǎng)基，該菌株在此培養(yǎng)基中發(fā)酵產(chǎn)凝乳酶的凝乳活力于72 h時(shí)達(dá)到最大值，為（431.53±15.89）SU/mL，且蛋白水解活力為（5.05±0.59）U/mL。凝乳酶的C/P值（凝乳活力與蛋白水解活力的比值）是干酪加工中凝固劑的一個(gè)重要的效率指標(biāo)。有研究表明凝乳酶的C/P值在100～200之間時(shí)，凝乳效果最佳，本實(shí)驗(yàn)菌株GSBa-1所產(chǎn)凝乳酶的C/P值為85.45，與上述比值接近，說明該實(shí)驗(yàn)菌株所產(chǎn)凝乳酶適用于干酪的加工。將該菌株在最大產(chǎn)酶活力時(shí)進(jìn)行凝乳酶的提取并冷凍干燥成凝乳酶凍干粉。通過菌株凝乳酶與商業(yè)凝乳酶做凝乳效果對(duì)比分析結(jié)果顯示，該菌株凝乳酶與商業(yè)凝乳酶凝乳效果相接近，凍干粉酶活力為1.54×105SU/g與商業(yè)凝乳酶活力（3.16×105SU/g）相差不大，后期可對(duì)菌株凝乳酶進(jìn)行分離純化以獲得更高酶活力的純凝乳酶，并進(jìn)行酶學(xué)特性和相關(guān)的凝乳機(jī)理研究。此外，分離篩選的純種解淀粉芽孢桿菌GSBa-1來源于酒曲，與同來源于酒曲中的真菌相比，具有發(fā)酵易于控制，產(chǎn)物易于提取分離等優(yōu)勢(shì)，更具備產(chǎn)業(yè)化開發(fā)應(yīng)用的潛力。
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