枝孢菌（Cladosporium link）是廣泛存在于自然界的一類真菌，可侵染植物葉片和根莖，造成果蔬及糧食作物產(chǎn)量降低，品質(zhì)下降。同時(shí)，枝孢菌也是蘋果、生菜、獼猴桃、草莓等果蔬采后腐爛的主要致病菌，造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。此外，枝孢霉還對人體健康產(chǎn)生威脅。
針對真菌病害控制，國內(nèi)外學(xué)者做了大量研究，如通過復(fù)配精油、臭氧、氣調(diào)、化學(xué)殺菌劑、拮抗菌、植物提取液、溫濕度調(diào)節(jié)等手段來抑制真菌的活性和繁殖能力，降低真菌病害的發(fā)生。氣調(diào)是當(dāng)今果蔬保鮮中較為有效的方法之一，其通過改變貯藏環(huán)境內(nèi)氣體比例并結(jié)合溫、濕度，來降低果蔬營養(yǎng)物質(zhì)消耗并抑制病原菌，以延長果蔬保鮮期，具有無毒、高效、天然的特點(diǎn)。
目前氣調(diào)保鮮多采用低O2、高CO2的氣體配比，雖然能在一定程度上抑制果蔬生理生化活動(dòng)，減少能量消耗，但易出現(xiàn)異味，CO2傷害等現(xiàn)象。本課題組前期研究表明，高O2配合高CO2保鮮有很好的協(xié)同作用，一方面通過高CO2降低果蔬的呼吸速率以延長果蔬貯藏期，另一方面通過高O2來緩解果蔬受到高CO2的傷害，提高果蔬的貯藏品質(zhì)，目前已成功應(yīng)用于西蘭花和生姜的采后貯藏，取得了較好的保鮮效果。然而，針對O2/CO2主動(dòng)自發(fā)氣調(diào)的抑菌效果尚未深入研究。
為此，本試驗(yàn)采用O2/CO2主動(dòng)自發(fā)氣調(diào)處理枝孢菌，通過定期測定枝孢菌的生長情況、菌株細(xì)胞膜透性、活性氧防御酶及細(xì)胞壁降解酶活性等指標(biāo)，探討O2/CO2主動(dòng)自發(fā)氣調(diào)的抑菌效果，為其在果蔬采后枝孢菌及其它微生物病害的防治方面提供理論依據(jù)。
1材料與方法
1.1材料與試劑
供試菌從貯藏期內(nèi)發(fā)病的獼猴桃上分離、純化，經(jīng)山東泓迅生物科技有限公司鑒定，Blast比對分析，確定為枝孢菌菌株（Cladosporium link）。
瓊脂、磷酸氫二鈉、羧甲基纖維素鈉、磷酸二氫鈉、果膠，天津市光復(fù)精細(xì)化工有限公司；葡萄糖、3，5-二硝基水楊酸（DNS）、乙二胺四乙酸（EDTA），天津市化學(xué)試劑研究所；乙酸、檸檬酸、無水乙醇、過氧化氫、愈創(chuàng)木酚、乙酸鈉、檸檬酸鈉，煙臺(tái)市雙雙化工有限公司；三羥甲基氨基甲烷（Tris）、鄰苯三酚、濃鹽酸、亞硫酸鈉，天津市凱通化學(xué)試劑有限公司；苯酚、氫氧化鈉、酒石酸鉀鈉，萊陽市康德化工有限公司。所用試劑均為分析純級(jí)。
1.2儀器與設(shè)備
GXZ-260B光照生化培養(yǎng)箱，寧波江南儀器廠；UV-1750紫外可見分光光度計(jì)，島津國際貿(mào)易有限公司；MR-07825-00 O2/CO2測定儀，美國FBI Dansensor公司；XW-80A渦旋混合器，上海青浦滬西儀器廠；DDS-307A電導(dǎo)率儀，上海精科雷磁儀器；XS-212-20光學(xué)顯微鏡，蘇州勝視電子設(shè)備有限公司；S-50HD立式自動(dòng)電熱壓力滅菌鍋，濟(jì)南來寶醫(yī)療器械有限公司；GL-20G-2臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)，上海安亭儀器制造廠；RDL380P氣調(diào)包裝機(jī)，羅迪博爾機(jī)械設(shè)備有限公司。
1.3試驗(yàn)設(shè)計(jì)
將經(jīng)3次活化后的枝孢菌擴(kuò)大培養(yǎng)后，制取濃度為106CFU/mL的孢子懸浮液，以5μL的接種量接種于培養(yǎng)皿中心（直徑9 cm），晾干后裝入氣調(diào)袋。然后向氣調(diào)袋內(nèi)分別充入體積為5 L的60%O2+40%CO2、70%O2+30%CO2、80%O2+20%CO2、90%O2+10%CO2和自然空氣（ck），置于生化培養(yǎng)箱（28±0.5）℃培養(yǎng)，每隔2 d測定相關(guān)指標(biāo)。每個(gè)處理設(shè)置10個(gè)氣調(diào)袋，每個(gè)氣調(diào)袋內(nèi)放置4個(gè)培養(yǎng)皿。
1.4指標(biāo)測定
1.4.1菌落形態(tài)觀察及直徑測定在培養(yǎng)皿內(nèi)直接觀察菌落形態(tài)，并使用十字交叉法測量菌落直徑，重復(fù)3次。
1.4.2微觀結(jié)構(gòu)觀察在菌落邊緣挑取菌絲固定在載玻片中央，然后直接在400×光學(xué)顯微鏡下觀察并拍照。
1.4.3孢子量的測定在菌落邊緣用打孔器（直徑6 mm）隨機(jī)取3個(gè)菌碟，置于已加入15 mL蒸餾水的離心管中，渦旋混合器振蕩10 min，然后使用2層紗布過濾并沖洗2次，顯微鏡下計(jì)數(shù)，并計(jì)算整個(gè)菌落面積的孢子總數(shù)。
1.4.4菌株細(xì)胞內(nèi)容物釋放量的測定用打孔器在菌落邊緣隨機(jī)打3個(gè)菌碟，置于0.05 mol/L，pH 7.2的磷酸鈉緩沖液中，超聲波破壁15 min后，4 000 r/min離心10 min，上清液在波長260 nm下測定吸光值。
1.4.5菌細(xì)胞電導(dǎo)率的測定上清液的獲取同1.4.4節(jié)的方法，使用電導(dǎo)率儀直接測定電導(dǎo)率。
1.4.6處理后枝孢霉后續(xù)生長曲線的測定取2 mL氣調(diào)處理8 d的枝孢菌孢子懸浮液（制取步驟同1.4.3節(jié)的方法）與18 mL PDB培養(yǎng)液混合，于28℃，200 r/min搖床培養(yǎng)，每隔4 h或6 h取樣，抽濾后在60℃下將菌絲體烘干并稱重。
1.4.7超氧化物歧化酶（SOD）活性的測定孢子懸浮液的制取同1.4.3節(jié)的方法（預(yù)冷的0.2 mol/L，pH 7.8的磷酸鈉緩沖液代替蒸餾水），并將孢子濃度稀釋至106CFU/mL，然后吸取8 mL菌液于10 mL離心管，冰浴超聲波破壁15 min后，4℃，12 000 r/min離心20 min，取上清液作為粗酶液。通過鄰苯三酚自氧化法測定SOD活性，25℃下降低鄰苯三酚自氧化速率50%所需要的量為1個(gè)酶活力單位（U）。
1.4.8過氧化氫酶（CAT）活性的測定粗酶液的制取同1.4.7節(jié)的方法（緩沖液使用0.2 mol/L，pH 7.0的磷酸鈉）。采用過氧化氫分解法測定CAT活性，將吸光值每秒鐘改變0.001定義為1個(gè)酶活力單位（U）。
1.4.9多聚半乳糖醛酸酶（PG）和多聚甲基半乳糖醛酸酶（PMG）活性的測定取8 mL濃度為106CFU/mL的孢子懸浮液（制取步驟同1.4.3節(jié)的方法），超聲波冰浴破壁15 min后，4℃，10 000 r/min離心10 min，上清液即為粗酶液。PMG和PG活性的測定分別用果膠酸鈉和果膠作為底物，采用DNS顯色法在波長540 nm處測定吸光度。將50℃下每分鐘內(nèi)每毫升酶液分解底物時(shí)釋放1μg還原糖所需要的酶量定義為1個(gè)酶活力單位（U）。
1.5數(shù)據(jù)處理
所得數(shù)據(jù)使用SPSS 19.0軟件進(jìn)行LSD顯著性分析及相關(guān)性分析（P＜0.05），并用Excel軟件作圖。
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