本文通過(guò)重疊PCR技術(shù)構(gòu)建獲得枯草芽胞桿菌（Bacillus subtilis）來(lái)源的谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶（transglutaminase，TG）（BTG）重組基因Sprodbtg，該基因依次包含SD序列、谷氨酸棒桿菌信號(hào)肽ΔS0949序列、proD-BTG基因，并將該目的基因克隆入大腸桿菌~谷氨酸棒桿菌穿梭表達(dá)載體pXMJ19中構(gòu)建重組質(zhì)粒pXMJ19-Sprodbtg.隨后，重組質(zhì)粒電轉(zhuǎn)入谷氨酸棒桿菌（Corynebacterium glutamicum）ATCC13032中進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，并對(duì)重組菌株的誘導(dǎo)條件進(jìn)行優(yōu)化。結(jié)果表明：重組菌株C.glutamicum ATCC13032/pXMJ19-Sprodbtg表達(dá)重組酶原蛋白proD-BTG經(jīng)活化后，BTG的活力達(dá)到（41.23±2.01）U/L；在重組菌培養(yǎng)12 h后誘導(dǎo)、IPTG終濃度0.8 mmol/L、誘導(dǎo)40 h的最優(yōu)誘導(dǎo)條件下，BTG的活力達(dá)到最高，為（55.62±2.34）U/L，較優(yōu)化前提高了約34.90%。
谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶（transglutaminase，TG）是一種催化酰基轉(zhuǎn)移反應(yīng)的轉(zhuǎn)移酶，催化蛋白質(zhì)分子內(nèi)和分子間發(fā)生交聯(lián)、蛋白質(zhì)和氨基酸之間的連接以及蛋白質(zhì)分子內(nèi)谷氨酰胺基的水解反應(yīng)。由于其安全、特有的交聯(lián)性質(zhì)，可用于改善蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)和功能性質(zhì)，在植物蛋白制品、焙烤制品、魚(yú)、肉、乳類(lèi)制品、固定化酶、可食性包裝等行業(yè)已有廣泛應(yīng)用。
目前，僅茂源鏈霉菌（Streptomyces mobaraense）谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶（MTG）實(shí)現(xiàn)了商業(yè)化生產(chǎn)，但茂源鏈霉菌生長(zhǎng)慢、發(fā)酵周期長(zhǎng)、酶活力收率低，造成MTG價(jià)格較高；另外，隨著食品加工業(yè)種類(lèi)逐漸增多，MTG的特性無(wú)法滿(mǎn)足一些食品加工底物和過(guò)程的需求，因此，亟需開(kāi)發(fā)不同特性的TG.枯草芽胞桿菌（Bacillus subtilis）谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶（BTG）是在1996年被Kobayashi等首次發(fā)現(xiàn)，且經(jīng)驗(yàn)證BTG的分子結(jié)構(gòu)沒(méi)有信號(hào)肽和前肽；Suzuki等發(fā)現(xiàn)BTG最適作用pH為8.2，最適作用溫度為60℃，可催化酪素液及BSA蛋白分子的凝膠化和交聯(lián)；并且，經(jīng)分析BTG和MTG在氨基酸序列和空間結(jié)構(gòu)上有很大區(qū)別，這為開(kāi)發(fā)新型TG奠定了基礎(chǔ)。
本研究室在前期研究中從枯草芽胞桿菌（B.subtilis）168ATCC23857基因組克隆了BTG基因，該基因僅編碼成熟肽，對(duì)異源宿主細(xì)胞有毒性，影響其正常生長(zhǎng)，難以實(shí)現(xiàn)BTG高效表達(dá)。研究發(fā)現(xiàn)，來(lái)自于生暗灰鏈霉菌（S.caniferus）的TG前肽proD對(duì)BTG活性的抑制率最高，達(dá)到70%.然而，大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)難以實(shí)現(xiàn)proD-BTG酶原的高效表達(dá)。谷氨酸棒狀桿菌蛋白分泌機(jī)制健全，生長(zhǎng)迅速，培養(yǎng)簡(jiǎn)便，使用安全，無(wú)致病性，是表達(dá)外源基因的良好受體菌，本研究室已利用谷氨酸棒桿菌表達(dá)系統(tǒng)實(shí)現(xiàn)了BTG的異源表達(dá)。因此，基于上述研究，本文以谷氨酸棒桿菌（Corynebacterium glutamicum）ATCC13032為宿主菌株，構(gòu)建重組菌株C.glutamicum ATCC13032/pXMJ19-Sprodbtg以實(shí)現(xiàn)proD-BTG的高效分泌表達(dá)，并對(duì)其誘導(dǎo)條件進(jìn)行優(yōu)化，旨在為BTG的研究奠定基礎(chǔ)。
1材料與方法
1.1材料
1.1.1菌株與質(zhì)粒
大腸桿菌（Escherichia coli）JM109、谷氨酸棒狀桿菌（C.glutamicum）ATCC13032、大腸桿菌~谷氨酸棒桿菌穿梭表達(dá)質(zhì)粒pXMJ19和克隆有prodbtg基因的質(zhì)粒pET28a-prodbtg均為本實(shí)驗(yàn)室保藏。
1.1.2酶與主要試劑
限制性?xún)?nèi)切酶HindⅢ和BamHⅠ、T4 DNA連接酶、Probest高保真酶，TaKaRa公司；溶菌酶、RNase，上海生工生物工程有限公司；小量瓊脂糖凝膠DNA試劑盒、PCR產(chǎn)物純化回收試劑盒、質(zhì)粒小量提取試劑盒，北京莊盟國(guó)際生物基因科技有限公司；BCA蛋白濃度試劑盒，碧云天生物技術(shù)研究所；蛋白胨和酵母浸粉，Oxoid公司；Factor Xa，Sigma公司；其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。
1.1.3培養(yǎng)基
LB培養(yǎng)基（g/L）：胰蛋白胨10，酵母浸出粉5，NaCl 5，pH 7.0.
LA培養(yǎng)基：LB+2%,瓊脂粉，pH 7.0——7.2.
谷氨酸棒桿菌復(fù)蘇培養(yǎng)基：LB+0.5%,葡萄糖，pH 7.0——7.2.
谷氨酸棒桿菌產(chǎn)MTG培養(yǎng)基（MMTG）（g/L）：葡萄糖60，MgSO41，（NH4）2SO430，KH2PO41.5，F(xiàn)eSO4·7H2O 0.01，MnSO4·4H2O 0.01，鹽酸硫胺素4.5×10-4，生物素4.5×10-4，甲硫氨酸0.15，CaCO350，pH 7.5.
1.1.4引物設(shè)計(jì)
為了使得外源蛋白在谷氨酸棒狀桿菌中實(shí)現(xiàn)高效分泌表達(dá)，設(shè)計(jì)含SD序列及C.glutamicum R來(lái)源的有高效分泌能力信號(hào)肽ΔS0949序列的重組proD-BTG基因序列。依據(jù)引物設(shè)計(jì)原則設(shè)計(jì)引物。上游引物P1：5′~TATCGGCGCTGCCAGCATGT TTATGCCAAAGGCCAACGCCCAAGGAGCACTCG AGGCCAGCGGCGGC-3′；P2：5′~CCCAAGCTT AAA GGAGGACACGCATGCAAATAAACCGCCGAGGCT TCTTAAAAGCCACCGCAGGACTTGCCACTATCG GCGCTGCCAGCATG-3′；下游引物R1：5′~CGCGG ATCC TTAGCGGACGATGCGG-3′。上游引物P15′端不含有酶切位點(diǎn)；上游引物P25′端含有HindⅢ酶切位點(diǎn)（AAGCTT）；下游引物R15′端含有BamHⅠ酶切位點(diǎn)（GGATCC）。
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