1.3.3高滲脅迫處理無菌條件下，用打孔器(直徑為7 mm)在01-23和STM-35菌落外緣打取菌盤，然后接種至3種不同山梨醇濃度(1.0，1.5，2.0 mol/L)的DPA培養(yǎng)基平板上，置于恒溫培養(yǎng)箱中25℃黑暗培養(yǎng)，以在無山梨醇的DPA培養(yǎng)基上生長的菌株為對照(CK)。
1.3.4菌落、菌絲形態(tài)觀察及生長速率測定將菌株在高滲固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)8 d后，觀察菌落形態(tài)，采用十字交叉法測量菌落直徑，計算抑制率，顯微觀察菌絲的形態(tài)特征及發(fā)育情況。
抑制率=(對照菌落直徑-高滲處理菌落直徑)/(對照菌落直徑)×100%。
1.3.5脂類物質(zhì)沉積的形態(tài)學(xué)觀察將2.0 mol/L山梨醇處理的WT和KO菌株利用油紅O染液進行脂肪染色、制片，并在顯微鏡下觀察脂類物質(zhì)沉積的形態(tài)學(xué)變化。染色參照陳侃等[17]的方法略作修改，具體步驟：取培養(yǎng)10 d的菌株，向培養(yǎng)皿中加入3 mL無菌水，輕輕刮取菌絲，用雙層擦鏡紙過濾，濾液經(jīng)12 000 r/min離心5 min后去掉上清，收集沉淀，用液氮反復(fù)凍融5次，轉(zhuǎn)入4%中性甲醛中固定12 h，取出用PBS漂洗后放入60%異丙醇中浸泡30 min，取出后加入50μL油紅O染液，黑暗條件下染色24 h，置于60%異丙醇中脫色，顯微鏡下觀察染色情況并照相。
1.4數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析
利用IBM SPSS Statistics(version 19)軟件(SPSS Inc.)對試驗數(shù)據(jù)進行ANOVA方差分析。
2結(jié)果與分析
2.1玉米大斑病菌高滲脅迫培養(yǎng)基的篩選
由于PDA培養(yǎng)基中馬鈴薯浸提液中含有鹽離子，并且不同馬鈴薯品種及熬煮時間都可能對其浸提液中鹽離子濃度產(chǎn)生影響，從而干擾本試驗中高滲脅迫分析結(jié)果。而蛋白胨作為一種化學(xué)產(chǎn)品，不僅排除了生產(chǎn)工藝的干擾，而且蛋白胨中不含鹽離子或鹽離子非常少，不會影響本試驗中高滲脅迫分析結(jié)果，因此本研究采用蛋白胨代替馬鈴薯浸提液的DPA培養(yǎng)基進行高滲脅迫分析。通過比較WT菌株與KO菌株在PDA和DPA培養(yǎng)基上的菌絲形態(tài)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在PDA培養(yǎng)基上WT菌株與KO菌株生長菌絲形態(tài)有較明顯的區(qū)別，WT菌株的菌絲細(xì)胞內(nèi)有明顯顆粒狀內(nèi)容物出現(xiàn)，而KO菌株的菌絲細(xì)胞內(nèi)無明顯顆粒狀內(nèi)容物。在DPA培養(yǎng)基上，WT菌株與KO菌株的菌絲細(xì)胞內(nèi)均有明顯的顆粒狀物出現(xiàn)，2種菌株的菌絲狀態(tài)相似。因此，DPA培養(yǎng)基更適于分析STK1基因?qū)B透脅迫的調(diào)控作用。
2.2山梨醇高滲脅迫對玉米大斑病菌菌落生長的影響
山梨醇高滲脅迫對玉米大斑病菌菌落生長速度的影響見圖1。
由圖1可以看出，在1.0 mol/L山梨醇脅迫條件下，KO菌株與WT菌株的菌落生長速度沒有顯著差異，但在1.5和2.0 mol/L山梨醇脅迫條件下，KO菌株的菌落生長速度都顯著低于WT菌株，表明KO菌株對較高濃度山梨醇的滲透脅迫比WT菌株更敏感。
對WT菌株，未加山梨醇和山梨醇濃度為1.0 mol/L的DPA培養(yǎng)基中，WT菌株的菌落生長速度基本上一致；當(dāng)山梨醇濃度大于1.0 mol/L時，濃度越大，菌落生長速度越慢(圖1-A)，即高濃度山梨醇對WT菌株菌落生長速度有顯著抑制作用。
對KO菌株，在1.0 mol/L山梨醇高滲脅迫條件下，KO菌株的生長速度顯著加快，當(dāng)山梨醇濃度增加到1.5和2.0 mol/L時，菌落生長速度又顯著減慢，說明一定濃度山梨醇高滲脅迫對KO菌株的菌落生長速度有促進作用，但高濃度山梨醇卻有抑制作用(圖1-A)。
由圖1-B可以看出，除在1.0 mol/L山梨醇脅迫條件下KO菌株的菌落生長速度得到顯著的促進作用以外，其它處理的菌落生長速度均受到顯著的抑制作用。在1.5和2.0 mol/L山梨醇滲透脅迫下，KO菌株菌落生長速度的抑制率顯著高于WT菌株。
2.3山梨醇高滲脅迫對玉米大斑病菌菌落形態(tài)和顏色的影響
在山梨醇高滲脅迫條件下，WT菌株和KO菌株的菌落形態(tài)沒有顯著變化，但菌落顏色變化非常明顯。在山梨醇高滲脅迫條件下，WT菌株的菌落顏色由黑色變?yōu)榛野咨?，而KO菌株則在1.5 mol/L山梨醇脅迫條件下菌落顏色變深，在1.0和2.0 mol/L山梨醇脅迫條件下菌落顏色變淺(圖2)。
圖2山梨醇高滲脅迫對玉米大斑病菌菌落形態(tài)和顏色的影響
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