在日常細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中經(jīng)常會(huì)涉及到對(duì)細(xì)胞活力和增長(zhǎng)情況的測(cè)定，而細(xì)胞生長(zhǎng)曲線是測(cè)定細(xì)胞絕對(duì)生長(zhǎng)數(shù)的常用方法，是判定細(xì)胞活力的重要指標(biāo)。細(xì)胞計(jì)數(shù)法是測(cè)定細(xì)胞生長(zhǎng)曲線最常用的方法之一，是利用血細(xì)胞計(jì)數(shù)板計(jì)量細(xì)胞懸液中細(xì)胞數(shù)量，從而推算細(xì)胞的增殖和鋪板密度的方法。
細(xì)胞計(jì)數(shù)法怎么鋪板如何換算？
實(shí)驗(yàn)背景知識(shí)
我們常用的用于計(jì)算細(xì)胞數(shù)的工具為血細(xì)胞計(jì)數(shù)板。在血細(xì)胞計(jì)數(shù)板上刻有相關(guān)的一些符號(hào)和數(shù)字，XB-K-25為計(jì)數(shù)板的型號(hào)和規(guī)格，表示此計(jì)數(shù)板分25個(gè)中格。計(jì)數(shù)區(qū)邊長(zhǎng)為1mm，則計(jì)數(shù)區(qū)的面積為1mm，每個(gè)小方格的面積為1/400mm2。
計(jì)數(shù)步驟
1.準(zhǔn)備血細(xì)胞計(jì)數(shù)板
在實(shí)驗(yàn)開始前，我們需要清潔干凈血細(xì)胞計(jì)數(shù)板（在鏡下觀察計(jì)數(shù)板，見計(jì)數(shù)池內(nèi)沒有影響后期觀察的纖維或雜點(diǎn)即可）。之后使用75%乙醇噴灑計(jì)數(shù)板，令流動(dòng)的乙醇帶下計(jì)數(shù)板上的灰塵及細(xì)碎臟物（可在乙醇流下的地方墊上干凈的布，或用廢液缸接著）。將計(jì)數(shù)板和蓋玻片晾干或用一塊干凈柔軟的布擦拭干凈備用。將蓋玻片輕輕覆蓋在計(jì)數(shù)板的計(jì)數(shù)池上方，將計(jì)數(shù)板轉(zhuǎn)移入超凈臺(tái)(注:使用前須保證蓋玻片和計(jì)數(shù)板已充分晾干，否則將影響后續(xù)細(xì)胞充池及計(jì)數(shù)結(jié)果。)
2.制備細(xì)胞懸液
對(duì)于貼壁細(xì)胞，我們需要先用胰酶消化的方法使細(xì)胞脫落，加入含血清培養(yǎng)基終止消化，之后離心并重懸細(xì)胞以得到均勻的細(xì)胞懸液；對(duì)于懸浮細(xì)胞，可以直接制成細(xì)胞懸液。
需要注意的是：消化過度和消化不完全都會(huì)造成結(jié)果偏差。重懸細(xì)胞時(shí)應(yīng)盡量將細(xì)胞吹散，但不能用力過度。
3.血細(xì)胞計(jì)數(shù)板加樣
將蓋玻片放置在血細(xì)胞計(jì)數(shù)板中間處，用小槍頭或者毛細(xì)吸管取10ul的細(xì)胞懸液（必要時(shí)可提前將細(xì)胞懸液稀釋10倍或更高倍數(shù)）然后將細(xì)胞懸液緩慢注入蓋玻片和計(jì)數(shù)板的接觸邊緣，虹吸作用會(huì)讓細(xì)胞懸液緩慢進(jìn)入小室，充滿間隙。細(xì)胞懸液進(jìn)入計(jì)數(shù)池后，靜置片刻，使細(xì)胞擴(kuò)散、沉降。將計(jì)數(shù)板穩(wěn)定地轉(zhuǎn)移至顯微鏡下進(jìn)行計(jì)數(shù)。
注意;操作過程中動(dòng)作穩(wěn)定，勿推動(dòng)蓋玻片，同時(shí)避免因?yàn)榛蝿?dòng)導(dǎo)致細(xì)胞懸液不均勻，甚至晃出計(jì)數(shù)室。
細(xì)胞計(jì)數(shù)及結(jié)果計(jì)算
1.細(xì)胞計(jì)數(shù)
細(xì)胞計(jì)數(shù)通常為兩種方法，分別為湯麥?zhǔn)剑▓D左）和希利格式（圖右）。
計(jì)數(shù)板由H形凹槽分為上下兩個(gè)計(jì)數(shù)池。將蓋玻片覆蓋在兩個(gè)計(jì)數(shù)池上方，形成深度為0.10mm的計(jì)數(shù)池。每個(gè)計(jì)數(shù)池又分為9個(gè)大格（下圖紅色邊框大方格），每個(gè)大格規(guī)格為1.00mm×1.00mm。其中，中央大方格又用雙線劃分為25個(gè)中方格，每個(gè)中方格用單線劃分為16個(gè)小方格。100倍顯微鏡下觀察情況，計(jì)算中央方格和四個(gè)角落的方格中的細(xì)胞數(shù)量。原則是計(jì)左不計(jì)右，計(jì)上不計(jì)下，也就是說，計(jì)算壓在左邊中線和上邊中線的細(xì)胞，但是不計(jì)算右邊中線和下邊中線的細(xì)胞。
2.結(jié)果計(jì)算
以上可知每個(gè)大方格的容積為：1mm2x0.1mm=0.1mm3=0.0001cm3=0.0001ml。即每個(gè)大方格的容積為萬分之一毫升，因此在計(jì)算每毫升液體中的細(xì)胞數(shù)時(shí)需乘以10000。如果有稀釋細(xì)胞懸液，則細(xì)胞密度=平均細(xì)胞數(shù)*10000*稀釋倍數(shù)（個(gè)/ml），細(xì)胞總數(shù)=細(xì)胞密度*細(xì)胞懸液體積（個(gè)）。
單細(xì)胞微生物生長(zhǎng)曲線的特點(diǎn)
單細(xì)胞微生物的典型生長(zhǎng)曲線主要分為延滯期、指數(shù)期、穩(wěn)定期和衰亡期，各階段的特點(diǎn)如下：
一、延滯期（lag phase）
延滯期的出現(xiàn)是因?yàn)閷⑸贁?shù)單細(xì)胞微生物接種至新鮮的培養(yǎng)環(huán)境中，這些單細(xì)胞微生物需要適應(yīng)新環(huán)境，沒有發(fā)生細(xì)胞數(shù)目增加的一段時(shí)期。在這個(gè)時(shí)期主要的特點(diǎn)是：生長(zhǎng)速率為零，細(xì)胞的形態(tài)增大或變長(zhǎng)，細(xì)胞內(nèi)RNA含量增高（尤其是rRNA），原生質(zhì)嗜堿性，合成代謝活躍（為下一個(gè)生長(zhǎng)階段作準(zhǔn)備），同時(shí)很容易受到外界理化因子的影響。
影響延滯期長(zhǎng)短的因素除了單細(xì)胞自身的菌種生長(zhǎng)特點(diǎn)外，還與接種齡、接種量、培養(yǎng)基成分和種子損傷程度有關(guān)。
接種齡是接種物或種子的所處的生理年齡，如果接種物處于指數(shù)期，那么子代培養(yǎng)物的延滯期就短，反之接種物處于延滯期或衰亡期，子代培養(yǎng)物的延滯期就長(zhǎng)。
接種量則是接種物的多少，很明顯，接種量大，其延滯期就短，反之則長(zhǎng)。
同樣的，培養(yǎng)基成分與接種物的營(yíng)養(yǎng)需求越適合和豐富，以及種子損傷程度低，那么其延滯期就短，反之就長(zhǎng)。
二、指數(shù)期（exponential phase）
指數(shù)期是接著在延滯期后面的一個(gè)時(shí)期，此時(shí)期的細(xì)胞數(shù)能夠以幾何級(jí)數(shù)進(jìn)行增長(zhǎng)。這一時(shí)期的特點(diǎn)主要是：生長(zhǎng)速率是最大的，所以細(xì)胞進(jìn)行一次分裂的時(shí)間是最短的，細(xì)胞進(jìn)行平衡生長(zhǎng)，即菌體各個(gè)部分十分均勻，并且酶十分活躍。
影響指數(shù)期的因素同樣與菌種有關(guān)，并且還有培養(yǎng)環(huán)境相關(guān)，包括營(yíng)養(yǎng)成分和濃度，以及培養(yǎng)溫度等條件。營(yíng)養(yǎng)成分和濃度越適合菌種生長(zhǎng)，培養(yǎng)環(huán)境也處于最合適的溫度，那么細(xì)胞增加一倍所需要的時(shí)間很明顯減少。
三、穩(wěn)定期（stationary phase)
穩(wěn)定期的出現(xiàn)是新繁殖的細(xì)胞和衰亡的細(xì)胞數(shù)目相同，即正生長(zhǎng)和負(fù)生長(zhǎng)處于一個(gè)動(dòng)態(tài)平衡的過程，此時(shí)的菌種量達(dá)到最高值，此時(shí)期的細(xì)胞開始以初生代謝物合成次生代謝物。
穩(wěn)定期的出現(xiàn)是因?yàn)榕囵B(yǎng)環(huán)境中的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)（主要是生長(zhǎng)限制因子）出現(xiàn)耗盡，營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的比例不平衡以及培養(yǎng)環(huán)境中累積了有害的代謝產(chǎn)物等等因素造成的。
四、衰亡期（decline phase或death phase）
衰亡期的出現(xiàn)是因?yàn)樯L(zhǎng)環(huán)境已經(jīng)不適合繼續(xù)生長(zhǎng)，菌體的分解代謝超過了合成代謝，進(jìn)而引起菌體出現(xiàn)大量死亡，此時(shí)新繁殖的細(xì)胞數(shù)目明顯少于衰亡的細(xì)胞數(shù)目，呈現(xiàn)一個(gè)負(fù)生長(zhǎng)的狀態(tài)。
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