1材料和方法


1.1材料與裝置


宿主藻：席藻(Phormidium sp.)為本課題組2009年在武漢分離得到[20]。噬藻體：噬藻體PP為本課題組2001年在武漢分離得到[26]。


自制SECT培養(yǎng)箱：培養(yǎng)箱的溫控系統(tǒng)由溫度控制器、風(fēng)扇、加熱器等組成，實測箱內(nèi)溫度波動范圍為±0.2℃。CO2濃度控制系統(tǒng)由CO2鋼瓶、緩沖箱、CO2控制器、電磁閥、氣泵、減壓閥等構(gòu)成，其中CO2鋼瓶中的高濃度CO2先經(jīng)減壓閥和電磁閥輸入至緩沖箱(一級CO2控制器通過控制電磁閥啟閉使緩沖箱內(nèi)的pCO2濃度為(2000±200)ppm)，緩沖箱內(nèi)的氣體再經(jīng)微型氣泵輸入至SECT培養(yǎng)箱(二級CO2控制器通過控制微型氣泵的啟閉使SECT培養(yǎng)箱內(nèi)的pCO2濃度的波動幅度達到±50 ppm)。


1.2宿主藻的培養(yǎng)


用AA液體培養(yǎng)基[35]培養(yǎng)席藻，光暗比為14 h∶10 h，光強為2000 lx。為更好地模擬全球氣候變化過程中大氣二氧化碳濃度升高的實際過程，采用頂空法控制pCO2濃度(而非直接將CO2通入培養(yǎng)液中)。SECT分組為：CK組，25℃+400 ppm；RCP4.5，27.4℃+538 ppm；RCP6.0，28.0℃+670 ppm；RCP8.5，29.8℃+936 ppm。其中，RCP4.5和RCP6.0代表中等強度的溫室效應(yīng)氣體排放，而RCP8.5代表高強度的溫室效應(yīng)氣體排放[1]。


為使席藻充分適應(yīng)上述溫度和二氧化碳條件，先使該藻在上述條件下傳代培養(yǎng)10個月后，再將其藻細胞密度稀釋至2.0×106 cells/mL，繼續(xù)在相應(yīng)SECT條件下培養(yǎng)，每天采用顯微鏡直接計數(shù)法測定藻細胞密度，并取對數(shù)期藻用于后續(xù)試驗。


1.3噬藻體PP對宿主藻的吸附率的測定


由于隨著RCP等級的逐步提高(主要是由于二氧化碳濃度的逐步升高)，對數(shù)期藻液的pH比對照組分別下降了0.05，0.10和0.25，為了使稀釋后的藻液仍保留此pH差異，取對數(shù)期藻液用0.02μm濾膜過濾收集濾液，再用濾液稀釋相應(yīng)的對數(shù)期藻液，使其初始藻細胞密度達到1.0×107 cells/mL。將效價(即具有增殖能力的病毒的濃度[36])為1.0×108 PFU/mL的噬藻體PP，按照MOI(multiplication of infectivity，即噬藻體效價與宿主細胞濃度的比例[36])為1∶104的比例加入稀釋后的藻液中，充分混勻后置于相應(yīng)SECT條件下培養(yǎng)，分別在0、15、30、45和60 min時取1 mL于12000×g離心5 min，采用96孔板法(8平行4梯度)測上清中的效價[36]。將0 min的效價記為P0，其它時間點的效價記為Pi，吸附率=(P0-Pi)/P0×100%[36]。


1.4裂解曲線和一步生長曲線的測定


用1.3中的方法將對數(shù)期藻液的細胞密度稀釋至1.0×107 cells/mL。加入初始效價為1.0×108 PFU/mL的噬藻體PP，使MOI為1∶1，混勻后放在對應(yīng)SECT條件下靜置吸附30 min。再將混合液于18000×g離心10 min，用相應(yīng)的濾過液對沉淀洗滌3次(以徹底去除未吸附的噬藻體PP)。再將樣品分為a、b兩組，a組用于顯微鏡檢計藻細胞數(shù)，b組則用上述濾過液梯度稀釋100倍和10000倍。將a、b樣品放在對應(yīng)SECT條件的搖床上100轉(zhuǎn)/min振蕩培養(yǎng)(用于防止已釋放的子代噬藻體PP吸附到臨近的藻絲上)，并分別在0、60、90、120、150、180、210、240、270和300 min時從a組中取樣鏡檢測量藻細胞數(shù)并據(jù)此繪制藻細胞的裂解曲線，同時從b組中取樣用96孔板法測量噬藻體PP的效價，各時間點的噬藻體釋放量=Pi/Ai(其中Ai為被裂解的藻細胞數(shù)=初始藻細胞數(shù)-該時刻的剩余藻細胞數(shù)，Pi為噬藻體效價的增加量=該時刻的噬藻體效價-初始噬藻體效價[36])，并據(jù)此繪制噬藻體PP的一步生長曲線。


1.5紫外損傷噬藻體的光修復(fù)率的測定


將噬藻體PP裂解液(其效價計為“原始效價”)置于12μW/cm2的UV-B燈下照射30 min進行紫外損傷處理后，取0.1 mL紫外損傷的噬藻體PP分別在白光和紅光條件下采用空斑法測定其效價。由于紫外損傷的噬藻體能夠在白光(主要是波長為300~500 nm的光)條件下被宿主光修復(fù)，而在波長大于620 nm的紅光條件下則不會發(fā)生光修復(fù)，故紫外損傷噬藻體的光修復(fù)率可通過以下公式計算得到[19]：


光修復(fù)率%=白光條件下的效價一紅光條件下的效價原始效價-紅光條件下的效價


(1)


1.6藻細胞密度的測定


先將隨機測量的20條藻絲總長度除以這20條藻絲的總細胞數(shù)，即得到每個藻細胞的平均長度，再將20~50個血球計數(shù)板計數(shù)室(每個計數(shù)室的體積為0.1 mm3)內(nèi)的藻絲總長度除以每個藻細胞的平均長度即得到這20~50個計數(shù)室內(nèi)的藻細胞數(shù)，并據(jù)此計算藻細胞密度。


1.7統(tǒng)計分析


上述試驗均設(shè)3個平行，作圖采用Graphpad Prism 5完成(圖表中的誤差量均用±SD表示)；數(shù)據(jù)分析采用SPSS 10.0完成，其中吸附率曲線采用單變量一般線性模型分析，宿主藻生物量、噬藻體平均釋放量和紫外損傷修復(fù)率采用單因素方差分析，多重比較采用最小顯著性差異法(least significant difference，LSD)法。


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