摘要：本文旨在研究發(fā)酵過程中產(chǎn)生的乙酸對(duì)重組大腸桿菌BL21（DE3）/pET15b-TreS的生長以及重組海藻糖合酶基因表達(dá)的影響，并對(duì)其作用機(jī)理進(jìn)行探討。
通過外源添加乙酸（鈉）的方法，研究了乙酸鈉對(duì)重組菌BL21（DE3）/pET15b-TreS生長曲線的影響；利用環(huán)境掃描電子顯微鏡，觀察了重組菌形態(tài)的變化情況；通過測(cè)定菌液的電導(dǎo)率值變化、菌液上清中OD260的變化，研究了乙酸（鈉）對(duì)菌體細(xì)胞膜滲透性、完整性的影響；通過測(cè)定菌液上清中β-半乳糖苷酶的活性檢測(cè)了乙酸鈉對(duì)菌體細(xì)胞內(nèi)膜的影響；利用熒光分析法檢測(cè)了乙酸對(duì)菌體膜蛋白構(gòu)象的影響；采用SDS-PAGE電泳研究了乙酸鈉對(duì)菌體重組海藻糖合酶表達(dá)量的影響。結(jié)果表明，乙酸（鈉）會(huì)對(duì)重組菌的生長產(chǎn)生一定的抑制作用，可以導(dǎo)致菌體細(xì)胞的表面出現(xiàn)凹陷、皺縮；并會(huì)影響細(xì)胞膜的滲透性、完整性，使得一些細(xì)胞內(nèi)容物發(fā)生泄漏；影響細(xì)胞膜上的膜蛋白構(gòu)象，對(duì)膜的結(jié)構(gòu)造成一定程度的破壞；對(duì)重組海藻糖合酶的表達(dá)產(chǎn)生影響。乙酸（鈉）對(duì)重組菌菌體的生長及重組海藻糖合酶基因的表達(dá)有影響，并且菌體細(xì)胞膜是其作用的一個(gè)靶點(diǎn)。
目前，隨著重組DNA技術(shù)與發(fā)酵培養(yǎng)技術(shù)的迅速發(fā)展，利用基因工程菌獲得所需產(chǎn)品的技術(shù)日趨成熟。由于大腸桿菌具有遺傳特性較清楚、易培養(yǎng)、發(fā)酵周期短并能實(shí)現(xiàn)目的基因的高效表達(dá)等特性，因而被廣泛應(yīng)用于基因工程菌的構(gòu)建。而重組菌的高細(xì)胞密度發(fā)酵是獲得高外源蛋白產(chǎn)量的一種重要手段，能夠提高單位時(shí)間單位體積的外源蛋白產(chǎn)率，重組大腸桿菌的高密度培養(yǎng)一般指培養(yǎng)液中菌體干細(xì)胞重量（dry cell weight，DCW）達(dá)50 g/L以上。利用重組大腸桿菌進(jìn)行高密度發(fā)酵可以有效地提高外源基因表達(dá)產(chǎn)物的產(chǎn)量，但是，大腸桿菌在進(jìn)行高密度發(fā)酵時(shí)會(huì)產(chǎn)生代謝副產(chǎn)物乙酸，Han認(rèn)為細(xì)菌在低比生長速率條件下通過氧化代謝作用產(chǎn)生的能量足以滿足合成和異化作用的需求，不會(huì)產(chǎn)生乙酸，而在高比生長速率時(shí)，大腸桿菌僅靠氧化代謝不能提供足夠的能量，必須通過乙酸生成途徑儲(chǔ)備ATP和NADH2。乙酸的生成需要兩個(gè)關(guān)鍵性的酶，磷酸轉(zhuǎn)乙酰酶（Pta）和乙酰激酶（Ack），它們催化葡萄糖代謝中從乙酰輔酶A生成乙酸的兩步酶促反應(yīng)。然而，乙酸的產(chǎn)生和積累不僅會(huì)影響菌體生長，還會(huì)對(duì)菌體生長和重組基因的表達(dá)產(chǎn)生抑制。
EL-Mansi和Luli假設(shè)的乙酸抑制機(jī)理為：乙酸在中性pH環(huán)境中以離子化（CH3COO-）和質(zhì)子化（CH3COOH）兩種形式存在，質(zhì)子化的乙酸具有弱的親脂性可以穿過細(xì)胞質(zhì)膜進(jìn)入胞內(nèi)，在胞內(nèi)（pH7.5）解離成CH3COO-和H+，這樣就降低了膜內(nèi)的pH值，使膜內(nèi)外的pH差（ΔpH）減小，減弱了質(zhì)子推動(dòng)力，產(chǎn)生的能量就被大大減少了，擾亂了細(xì)胞的正常代謝和生理活性。而陰離子增加了細(xì)胞內(nèi)部滲透壓，并干擾甲硫氨酸的合成。有試驗(yàn)證明，培養(yǎng)時(shí)pH越低，乙酸未解離形式含量越高，乙酸抑制作用就越強(qiáng)。
此外，研究表明，乙酸會(huì)影響數(shù)種蛋白和基因，特別是那些涉及大腸桿菌轉(zhuǎn)錄及翻譯機(jī)制、一般應(yīng)激反應(yīng)和調(diào)節(jié)的蛋白和基因。而且，乙酸對(duì)產(chǎn)重組蛋白的細(xì)胞抑制作用比對(duì)野生型的細(xì)胞抑制作用更強(qiáng)，同時(shí)細(xì)胞誘導(dǎo)表達(dá)蛋白后產(chǎn)生乙酸的臨界比生長速率更低。
在利用重組大腸桿菌BL21（DE3）/pET15b-TreS進(jìn)行高密度發(fā)酵生產(chǎn)海藻糖合酶的過程中，發(fā)酵液中會(huì)有大量代謝副產(chǎn)物乙酸的積累，而且會(huì)影響海藻糖合酶的酶活。根據(jù)這些檢測(cè)結(jié)果，本研究采取外源添加的方法，研究乙酸對(duì)重組大腸桿菌的生長及外源海藻糖合酶基因表達(dá)的影響，并分析其對(duì)細(xì)胞的抑制機(jī)理，包括對(duì)細(xì)胞膜、目的蛋白表達(dá)量的抑制作用，旨在為了解發(fā)酵過程中乙酸對(duì)菌體作用的機(jī)理，以控制培養(yǎng)條件，降低對(duì)菌體生長及產(chǎn)物產(chǎn)量的影響。
高密度發(fā)酵的過程中乙酸抑制重組大腸桿菌生長及外源基因的表達(dá)——摘要
高密度發(fā)酵的過程中乙酸抑制重組大腸桿菌生長及外源基因的表達(dá)——材料與方法
高密度發(fā)酵的過程中乙酸抑制重組大腸桿菌生長及外源基因的表達(dá)——結(jié)果
高密度發(fā)酵的過程中乙酸抑制重組大腸桿菌生長及外源基因的表達(dá)——討論、結(jié)論
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