1、材料與方法
1.1材料
1.1.1試驗菌株大腸桿菌BL21（DE3）/pET15b-Tres（本實驗室構(gòu)建菌種）。
1.1.2培養(yǎng)基LB液體培養(yǎng)基（%）：酵母浸粉0.5，蛋白胨1.0，NaCl 1.0。
M9乳糖誘導培養(yǎng)基（%）：Na2HPO4·12H2O 1.72，KH2PO40.3，NaCl 0.05，NH4Cl 0.1，MgSO40.05，CaCl20.001，乳糖0.5。
β-半乳糖苷酶反應(yīng)緩沖液（%）：NaCl 0.8，KCl 0.02，Na2HPO4·12H2O 0.29，KH2PO40.024，MgSO4·7H2O 0.025，β-巰基乙醇0.39。
氨芐青霉素（Amp）：50 mL無菌水中加入0.5 g氨芐西林鈉（0.5 g/瓶）。
其他試劑均為分析純。
1.1.3儀器振蕩培養(yǎng)箱；立式自動電熱壓力蒸汽滅菌鍋；標準型凈化工作臺；電子天平；隔水式恒溫培養(yǎng)箱；往復式水浴恒溫振蕩器；DDS-11A電導率儀；紫外可見分光光度計；全自動微生物生長分析儀；ChampGel5 500生物電泳凝膠成像分析系統(tǒng)；F-4500熒光分光光度計；5804R高速冷凍離心機。
1.2方法
1.2.1菌種的活化培養(yǎng)配制
LB液體培養(yǎng)基經(jīng)121℃滅菌20 min后，冷卻，于培養(yǎng)基中加入Amp（終濃度為100 mg/L）后接菌，37℃、180 r/min的條件下培養(yǎng)24 h。取菌液在加有Amp的固體培養(yǎng)基上進行劃線培養(yǎng)，挑取生長狀況較好的單個菌落進行液體培養(yǎng)基擴增。
1.2.2對生長曲線的影響
取活化后的大腸桿菌BL21（DE3）/pET15b-TreS按1%的接種量分別接種于9個100 mL加有Amp的LB培養(yǎng)基中，加入滅菌的乙酸鈉溶液，使其終濃度分別為0、0.5、1、2、4、5、10、20和30 g/L，于37℃、180 r/min的條件下培養(yǎng)，并在不同的時間點取樣測OD值，繪制生長曲線。
1.2.3對細胞顯微特征的影響
將培養(yǎng)至對數(shù)生長期的重組菌于5 000 r/min，4℃條件下離心10 min，棄上清，收集菌體，用無菌生理鹽水洗滌3次，并稀釋至菌體濃度約為107CFU/mL。
取制備的重組菌菌懸液20 mL，分別加入乙酸（使其終濃度分別為6.25 g/L和25 g/L）、乙酸鈉溶液（使其終濃度分別為6.72 g/L和26.88 g/L），同時設(shè)置無菌生理鹽水對照組，37℃孵育2 h。將對照組和試驗組的重組菌菌液離心收集菌體，洗滌后用2.5%的戊二醛于4℃條件下固定2 h后涂片，使樣品自然風干。制備的樣品用環(huán)境掃描電子顯微鏡觀察重組菌形態(tài)的變化情況。
1.2.4對菌體細胞膜通透性的影響
將培養(yǎng)至對數(shù)期的重組菌菌體，用無菌水稀釋至菌液濃度為107CFU/mL，取稀釋后的菌液27 mL，加入3 mL抑菌成分，分別為乙酸（終濃度分別為：3.125、6.25、12.5和25 g/L）、乙酸鈉（終濃度分別為：3.36、6.72、13.44和26.88 g/L），同時設(shè)置無菌水對照組，置于37℃恒溫水浴振蕩器中，然后分別在0、10、20、30、40、50和180 min時測定其電導率值。
1.2.5對菌體細胞膜完整性的影響
將培養(yǎng)至對數(shù)期的重組菌菌體，用生理鹽水稀釋至菌體濃度為107CFU/mL左右，取稀釋后的菌液45 mL，加入5 mL不同濃度的抑菌成分，分別為乙酸（終濃度分別為：3.125、6.25、12.5和25 g/L）、乙酸鈉（終濃度分別為：3.36、6.72、13.44和26.88 g/L），并設(shè)置空白對照組，然后置于37℃恒溫水浴振蕩器中，分別在不同時間點取樣，并在6 000 r/min的條件下，離心5 min，取上清用紫外分光光度計測其在260 nm處的吸光值。
1.2.6對細胞內(nèi)膜的滲透性影響
培養(yǎng)重組菌至對數(shù)生長期，取菌液10 mL進行離心，菌體用無菌生理鹽水洗滌兩次，轉(zhuǎn)移至100 mL的M9乳糖誘導培養(yǎng)基中，于37℃恒溫振蕩培養(yǎng)10 h，然后離心，收集菌體，用β-半乳糖苷酶反應(yīng)緩沖液重懸至OD600為0.2左右。
取9 mL反應(yīng)緩沖液重懸的菌液，分別加入1 mL不同濃度的乙酸鈉（終濃度分別為：3.36、6.72、13.44和26.88 g/L）混勻，37℃孵育2 h后離心菌體，取上清4.5 mL，再加入500μL 1 mg/mL的鄰硝基苯-β-D-吡喃半乳糖苷（ONPG），置于37℃恒溫水浴中，孵育2 h后，于420 nm的波長下測其吸光值。
1.2.7熒光分析法測乙酸對菌體膜蛋白構(gòu)象的影響
將重組菌培養(yǎng)至對數(shù)生長期，離心、洗滌菌體，用生理鹽水重懸，濃度約為107CFU/mL，分別在5 mL滅菌的EP管中加入1 mL的菌懸液，然后加入1 mL不同濃度的冰乙酸（乙酸的終濃度依次為0、3.125、6.25、12.5和25 g/L），于37℃恒溫水浴鍋中保溫1h后，置于日立F-4500熒光分光光度計上進行檢測。
1.2.8對蛋白質(zhì)合成的影響將重組菌培養(yǎng)至對數(shù)生長期，按1%接種量分別接種于100 mL加Amp的LB液體培養(yǎng)基中，同時分別加入0.1 g/L滅菌的乙酸鈉溶液，使得乙酸鈉的終濃度分別為0.5、1、2、3、4和5 g/L，并設(shè)置對照組，培養(yǎng)8 h后，加入乳糖誘導，誘導12 h后，收集菌體，并進行洗滌，將洗滌后的菌體用pH7.4的磷酸緩沖液懸浮至吸光值相同，經(jīng)超聲破碎后離心取上清，進行SDS-PAGE。配制濃度為5%的濃縮膠和濃度為12%的分離膠進行蛋白電泳，取上清液樣品20μL與20μL上樣緩沖液混合，于沸水中煮沸10 min后，進行點樣。
高密度發(fā)酵的過程中乙酸抑制重組大腸桿菌生長及外源基因的表達——摘要
高密度發(fā)酵的過程中乙酸抑制重組大腸桿菌生長及外源基因的表達——材料與方法
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