3、討論
在利用重組大腸桿菌進(jìn)行高密度發(fā)酵的過(guò)程中，發(fā)酵液中會(huì)有代謝副產(chǎn)物乙酸的積累，乙酸的存在抑制工程菌的生長(zhǎng)及外源基因的表達(dá)。乙酸對(duì)重組大腸桿菌的抑制作用已有報(bào)道，本研究根據(jù)實(shí)驗(yàn)中出現(xiàn)的這一現(xiàn)象，進(jìn)行了更加深入的理論基礎(chǔ)研究，對(duì)乙酸的抑制作用機(jī)理進(jìn)行了探討。
研究中發(fā)現(xiàn)，在加入乙酸鈉的環(huán)境中，菌體會(huì)出現(xiàn)一定的適應(yīng)期，較低濃度（0.5、1和2 g/L）的乙酸鈉對(duì)菌體影響較小，并且可能是由于質(zhì)子化的乙酸根進(jìn)入細(xì)胞后，可以作為碳源參與到細(xì)胞內(nèi)的代謝中，供菌體生長(zhǎng)所用，所以會(huì)對(duì)菌體生長(zhǎng)稍有促進(jìn)；而在較高乙酸鈉濃度下，菌體細(xì)胞或其代謝過(guò)程可能會(huì)被破壞，因而菌體生長(zhǎng)受到嚴(yán)重抑制。本研究首先研究了乙酸、乙酸鈉對(duì)重組大腸桿菌細(xì)胞形態(tài)及顯微特征的影響，發(fā)現(xiàn)菌體會(huì)發(fā)生皺縮或者凹陷，有些菌體周?chē)梢钥闯鲱?lèi)似發(fā)生了內(nèi)容物的外泄，這可能是由于乙酸、乙酸鈉引起了菌體細(xì)胞膜的破壞，進(jìn)而導(dǎo)致了菌體形態(tài)的變化甚至內(nèi)容物的外泄。
根據(jù)上述現(xiàn)象，通過(guò)實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步研究了乙酸、乙酸鈉對(duì)于菌體細(xì)胞膜的影響，細(xì)菌的細(xì)胞膜具有一定的流動(dòng)性，當(dāng)細(xì)菌細(xì)胞膜遭到破壞，使得其半透性及流動(dòng)性降低時(shí)，細(xì)胞的內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定性會(huì)被破壞，從而導(dǎo)致內(nèi)部的電解質(zhì)（如K+）外滲，培養(yǎng)液的電導(dǎo)率上升。細(xì)菌細(xì)胞膜是細(xì)菌的結(jié)構(gòu)組分，不僅是細(xì)胞的保護(hù)屏障，也是在細(xì)胞的生命活動(dòng)中有著復(fù)雜功能的重要結(jié)構(gòu)。當(dāng)細(xì)胞膜遭到破壞時(shí)，首先細(xì)胞內(nèi)的小分子物質(zhì)外滲出來(lái)，然后是DNA和RNA等一些大分子的外滲，而DNA和RNA在260 nm處有強(qiáng)吸收，因此，對(duì)260 nm吸收物質(zhì)的檢測(cè)被廣泛應(yīng)用于測(cè)定細(xì)胞膜的完整性。測(cè)定處理后菌液電導(dǎo)率的變化反映了細(xì)菌細(xì)胞膜通透性的變化，通過(guò)測(cè)定處理后菌液上清在260 nm處的吸光度值變化推測(cè)菌體細(xì)胞膜的完整性變化，而這兩個(gè)實(shí)驗(yàn)結(jié)果比較復(fù)雜，分析可能涉及到乙酸、乙酸鈉的解離和水解問(wèn)題，但結(jié)果說(shuō)明菌體細(xì)胞膜的通透性與完整性都會(huì)受到一定的影響。
細(xì)菌在受到乳糖誘導(dǎo)后均可產(chǎn)生β-半乳糖苷酶，β-半乳糖苷酶是位于細(xì)胞內(nèi)的水解酶，能使乳糖水解成半乳糖和葡萄糖。鄰硝基苯β-D-半乳吡喃糖苷（ONPG）是乳糖的類(lèi)似物，β-半乳糖苷酶可以將ONPG水解成半乳糖和黃色的鄰-硝基苯酚，因此可以通過(guò)顏色的變化測(cè)知β-半乳糖苷酶的活性。實(shí)驗(yàn)通過(guò)測(cè)定菌液上清中的β-半乳糖苷酶的活性，來(lái)檢測(cè)胞內(nèi)大分子滲透至胞外的情況，進(jìn)而說(shuō)明細(xì)胞內(nèi)膜的受損情況，不同濃度的乙酸鈉對(duì)其作用后會(huì)有影響，但差別較小。
蛋白質(zhì)分子中因含有色氨酸（Trp）、酪氨酸（Tyr）和苯丙氨酸（Phe）等氨基酸殘基而產(chǎn)生內(nèi)源性熒光。在大多數(shù)情況下，可以認(rèn)為蛋白質(zhì)所顯示的熒光主要來(lái)自色氨酸殘基，其變化直接反映了蛋白質(zhì)中色氨酸殘基本身及其周?chē)h(huán)境的變化。當(dāng)某些小分子如藥物等物質(zhì)與蛋白質(zhì)結(jié)合時(shí)，導(dǎo)致其熒光強(qiáng)度下降，稱(chēng)為熒光淬滅作用。根據(jù)Trp的激發(fā)波長(zhǎng)Ex，固定Ex，通過(guò)日立F-4500熒光分光光度計(jì)在310-450 nm范圍內(nèi)掃描即可確定Trp在重組大腸桿菌膜蛋白中的發(fā)射波長(zhǎng)Em。
為了確定Trp在重組大腸桿菌膜中的位置，需要將猝滅劑KI（1 mol/L）稀釋成不同濃度（0、0.01、0.02、0.05和0.1 mol/L）加入，檢測(cè)對(duì)Trp發(fā)射波長(zhǎng)Em的峰位和峰高的影響。如果Em迅速降低，則表明該氨基酸殘基位于表面，如果Em變化不大，則表明該氨基酸殘基位于膜內(nèi)，如果Em逐漸降低，就表明該氨基酸殘基的位置有兩種可能，可能是在膜內(nèi)也有可能是在膜外。結(jié)果表明乙酸能夠改變細(xì)胞膜的結(jié)構(gòu)，使位于細(xì)胞膜內(nèi)的Trp殘基暴露于細(xì)胞膜外。這個(gè)結(jié)論比較明確地說(shuō)明了乙酸會(huì)對(duì)細(xì)胞膜產(chǎn)生影響，進(jìn)而影響其功能。
在研究乙酸鈉對(duì)蛋白合成的影響時(shí)，可以看到明顯的趨勢(shì)，低濃度下乙酸鈉的添加會(huì)促進(jìn)海藻糖合酶的表達(dá)量，而高濃度的乙酸鈉又會(huì)起到抑制作用。其原因可能是乙酸根會(huì)影響DNA的復(fù)制或表達(dá)，也可能是乙酸鈉使菌體細(xì)胞膜受到損壞，導(dǎo)致一部分酶發(fā)生了外泄造成的。
在研究過(guò)程中，采用的是菌液中外源添加乙酸、乙酸鈉的方法，由于乙酸在溶液中的存在形式有乙酸分子形式及乙酸根形式，則試驗(yàn)中分別對(duì)兩種形式進(jìn)行了研究，添加乙酸、乙酸鈉至所需的濃度后，菌液的pH變化與對(duì)照組相差較小，因此主要考慮了乙酸、乙酸根的影響。
據(jù)已有的研究表明，某些抑菌劑可與細(xì)菌染色體DNA發(fā)生相互作用，導(dǎo)致DNA的復(fù)制、轉(zhuǎn)錄以及表達(dá)受到抑制。本試驗(yàn)中乙酸會(huì)影響海藻糖合酶的表達(dá)量，這可能是由于乙酸對(duì)胞內(nèi)DNA、RNA等產(chǎn)生抑制作用直接影響其表達(dá)量，也可能是由于隨著乙酸濃度的增大，重組菌細(xì)胞的通透性、結(jié)構(gòu)等發(fā)生變化，導(dǎo)致部分蛋白發(fā)生泄露，因而影響了目的蛋白的含量。具體的機(jī)制還需要今后做進(jìn)一步研究，進(jìn)行驗(yàn)證。
4、結(jié)論
根據(jù)發(fā)酵過(guò)程中的檢測(cè)初步研究了乙酸（鈉）對(duì)重組大腸桿菌的抑制作用及部分作用機(jī)理。通過(guò)外源添加乙酸（鈉）的方法，對(duì)重組菌的生長(zhǎng)曲線(xiàn)、細(xì)胞膜通透性、細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)、細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)、蛋白表達(dá)等方面進(jìn)行了研究，結(jié)果表明，乙酸（鈉）作用于重組菌后，可使其生長(zhǎng)受到抑制，且隨濃度的不同而發(fā)生變化；細(xì)胞膜的通透性會(huì)有所增加，細(xì)胞膜的完整性及膜的結(jié)構(gòu)受到破壞，導(dǎo)致部分細(xì)胞內(nèi)容物發(fā)生泄露；菌體正常形態(tài)發(fā)生變化；重組海藻糖合酶的表達(dá)受到影響。
高密度發(fā)酵的過(guò)程中乙酸抑制重組大腸桿菌生長(zhǎng)及外源基因的表達(dá)——摘要
高密度發(fā)酵的過(guò)程中乙酸抑制重組大腸桿菌生長(zhǎng)及外源基因的表達(dá)——材料與方法
高密度發(fā)酵的過(guò)程中乙酸抑制重組大腸桿菌生長(zhǎng)及外源基因的表達(dá)——結(jié)果
高密度發(fā)酵的過(guò)程中乙酸抑制重組大腸桿菌生長(zhǎng)及外源基因的表達(dá)——討論、結(jié)論
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