人們?cè)?jīng)認(rèn)為D－氨基酸在生物進(jìn)程中發(fā)揮著相對(duì)較少的作用，并稱(chēng)之為“非天然氨基酸”。然而近期的研究表明，D－氨基酸在細(xì)胞結(jié)構(gòu)及信號(hào)調(diào)控中發(fā)揮著重要的作用，科學(xué)家們認(rèn)為闡明D－氨基酸如何調(diào)控細(xì)胞壁重塑及生物被膜降解的機(jī)制不僅能夠?qū)?xì)胞質(zhì)外的進(jìn)程有一個(gè)新的理解，并且能夠促進(jìn)新療法的發(fā)展［1］。隨著研究的不斷深入，D－氨基酸在醫(yī)藥、農(nóng)業(yè)和食品等領(lǐng)域的用途被迅速發(fā)掘，如D－氨基酸及其衍生物作為重要的手性原材料被廣泛地應(yīng)用于半合成抗生素、多肽激素、殺蟲(chóng)劑和甜味劑等的合成中。
目前，隨著應(yīng)用的推廣，D－氨基酸的工業(yè)需求量也逐漸增大。D－氨基酸制備方法主要有：對(duì)映體拆分法、化學(xué)合成法和生物法。酶法合成作為生物法中應(yīng)用最多的方法，具有無(wú)污染、反應(yīng)條件溫和、操作簡(jiǎn)便、成本低、產(chǎn)物純度高等優(yōu)點(diǎn)，展現(xiàn)出很好的商業(yè)前景［6］。在酶法合成D－氨基酸的過(guò)程中，D－氨基?；甘侵饕褂玫膸追N酶之一。迄今已發(fā)現(xiàn)的產(chǎn)D－氨基?；傅奈⑸锇óa(chǎn)堿菌屬、假單胞菌屬、貪噬菌屬、狹長(zhǎng)平胞屬、擬無(wú)枝酸菌屬、博德特菌屬、葡萄糖菌屬、甲基桿菌屬、類(lèi)諾卡氏菌屬、微桿菌屬、鏈霉菌屬和木霉屬等［7］。其中，來(lái)自產(chǎn)堿菌屬的D－氨基?；敢呀?jīng)應(yīng)用于工業(yè)化生產(chǎn)［8］。然而，國(guó)內(nèi)對(duì)D－氨基酰化酶的研究還處于基礎(chǔ)階段，商品酶仍需進(jìn)口。
土壤篩選是獲得產(chǎn)酶微生物的重要途徑。作者從氨基酸類(lèi)化工廠附近土樣中篩選產(chǎn)D－氨基?；傅木?，并對(duì)活性較高的菌株進(jìn)行了鑒定及培養(yǎng)條件的初步優(yōu)化。
1實(shí)驗(yàn)
1.1材料與試劑
土樣采自江蘇省某氨基酸類(lèi)化工廠排污區(qū)附近。
細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒、質(zhì)粒小量提取試劑盒、瓊脂糖凝膠回收試劑盒，上海生工生物工程有限公司；250bp DNA Ladder Marker，寶生物工程（大連）有限公司；Taq DNA聚合酶，北京康為世紀(jì)有限公司；DNA引物（PAEG純），上海捷瑞公司；其它化學(xué)試劑均為分析純或色譜純。
1.2培養(yǎng)基
分離培養(yǎng)基：N－乙酰－D－甲硫氨酸1%，K2HPO4·3H2O 0.1%，MgSO4·7H2O 0.05%，瓊脂2%，蒸餾水配制，調(diào)節(jié)pH值至7.0。
發(fā)酵培養(yǎng)基：N－乙酰－D－甲硫氨酸1%，K2HPO4·3H2O 0.1%，MgSO4·7H2O 0.05%，酵母浸膏2%，蒸餾水配制，調(diào)節(jié)pH值至7.0。
1.3方法
1.3.1菌株的分離
采用平板稀釋法從土樣中分離菌株。取土壤樣品5g，用無(wú)菌生理鹽水逐級(jí)稀釋至10－1、10－2、10－3、10－4、10－5數(shù)量級(jí)，各取0.2mL均勻涂布于分離平板上，每個(gè)稀釋度涂3個(gè)平板，30℃倒置培養(yǎng)48h。觀察并挑選生長(zhǎng)快速、菌落較大的菌株劃線(xiàn)純化，純化的菌株斜面置于4℃冰箱保存［9］。
1.3.2菌株的篩選
1.3.2.1初篩
將純化的菌株轉(zhuǎn)接到發(fā)酵培養(yǎng)基中，于30℃、200 r·min－1搖瓶培養(yǎng)48h。低溫離心收集菌體，菌體用適當(dāng)比例的50mmol·L－1Tris－HCl緩沖溶液（pH值7.8）充分懸浮，加入適量200mmol·L－1的底物N－乙酰－D－甲硫氨酸至濃度為20mmol·L－1，混合均勻，于37℃恒溫水浴振蕩1h，之后立即沸水浴10min終止反應(yīng)。離心后取上清液1μL點(diǎn)樣進(jìn)行蛋氨酸的硅膠薄層層析，展開(kāi)劑為V（正丁醇）∶V（冰乙酸）∶V（水）＝4∶1∶1。每次需展開(kāi)劑25mL，另加入1mL 0.5%茚三酮溶液，混合均勻，展開(kāi)結(jié)束后，電吹風(fēng)熱風(fēng)吹干；顯色斑點(diǎn)與0.05mmol·L－1蛋氨酸的標(biāo)樣斑點(diǎn)比較，檢測(cè)蛋氨酸的含量以反映D－氨基?；傅幕盍Α榱讼迷噭┖途w本身所含氨基酸對(duì)測(cè)定的干擾，將懸浮后的菌體先煮沸10min，然后加入底物，其余操作同上，作為空白對(duì)照。保留蛋氨酸斑點(diǎn)較大且無(wú)雜斑點(diǎn)的菌株進(jìn)行復(fù)篩［10］。
1.3.2.2復(fù)篩
將初篩保留的菌株轉(zhuǎn)接到發(fā)酵培養(yǎng)基中，于30℃、200r·min－1搖瓶培養(yǎng)48h；采用茚三酮比色法測(cè)定酶活［10］，方法同1.3.2.1。
酶活力單位（U）定義：在pH值7.8、37℃條件下，1min內(nèi)酶催化底物水解釋放出1μmol D－甲硫氨酸為1U。
1.3.3菌株A55的鑒定
1.3.3.1形態(tài)學(xué)特征觀察及生理生化特征測(cè)定
依據(jù)《伯杰氏細(xì)菌鑒定手冊(cè)》（第八版）［11］和《常見(jiàn)細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊(cè)》［12］進(jìn)行試驗(yàn)，鑒定菌種。
1.3.3.2菌株A55的16SrDNA序列測(cè)定及系統(tǒng)發(fā)育分析
利用細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒提取菌株A55的基因組DNA。以基因組DNA為模板，用細(xì)菌16S rDNA基因通用引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR擴(kuò)增參數(shù)：94℃預(yù)變性4min；94℃解鏈40s，55℃退火40s，72℃延長(zhǎng)1.5min，30個(gè)循環(huán)；最后72℃延長(zhǎng)10 min。PCR產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠檢測(cè)，純化后交南京思普金公司測(cè)序。將測(cè)序得到的16SrDNA序列通過(guò)Blast與GenBank中細(xì)菌及古菌的16SrDNA序列進(jìn)行比對(duì)，利用Mega5.2軟件進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育分析。采用鄰接法（neighbor－joining method）構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)，并對(duì)所構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)進(jìn)行自舉分析（bootstrap method，1 000次重復(fù)），估算其內(nèi)分支的支持率［13］。
1.3.4影響D－氨基?；负铣傻囊蛩乜疾?
以發(fā)酵培養(yǎng)基為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，考察培養(yǎng)溫度、培養(yǎng)基初始pH值、搖床轉(zhuǎn)速、搖瓶裝樣量、菌齡、碳源、氮源等對(duì)菌體生長(zhǎng)及酶活力的影響，優(yōu)化菌株A55的培養(yǎng)條件［14］。
相關(guān)新聞推薦
1、不同耐藥性致病副溶血性弧菌在20℃、25℃、37℃下的生長(zhǎng)曲線(xiàn)（一）
2、新的微生物種間和跨界相互作用模式——操控自身的抗真菌化合物抑制鄰近真菌的生長(zhǎng)