2結果
2.1對生長曲線的影響
在一定范圍內，菌液的細胞濃度與吸光度值（OD值）成正比，試驗中采用OD600來衡量重組大腸桿菌的細胞密度。因此，通過測定OD值的變化來間接地表示乙酸鈉對重組菌生長的抑制情況。
乙酸根對重組大腸桿菌生長曲線的影響結果（圖1）顯示，在培養(yǎng)基中加入乙酸鈉對BL21（DE3）/pET15b-Tres的生長會產生影響，菌體的生長明顯受到抑制，使得菌體生長的延滯期延長，且抑制作用隨濃度的增大而增強，而乙酸鈉濃度為0.5 g/L時，對菌體生長的抑制較弱，其他濃度下，0-6 h內，生長較緩慢。在6 h之后，較低濃度（乙酸鈉濃度低于5 g/L）下，菌體生長受到的抑制減弱，而在較高濃度（乙酸鈉濃度為10、20和30 g/L）下，菌體生長被嚴重抑制，生長依然緩慢。
圖1不同濃度乙酸鈉對重組菌生長曲線的影響
2.2對細胞顯微特征的影響
經電子顯微鏡觀察對照組的重組大腸桿菌的形態(tài)，如圖2中A-1、A-2所示，其細胞形態(tài)比較完整、飽滿。而試驗組中用不同濃度的乙酸、乙酸鈉處理過的重組菌，形態(tài)發(fā)生了不同的變化。其中，用濃度為6.25 g/L和25 g/L的乙酸處理過的菌體形態(tài)如圖2-B、2-C所示，用濃度分別為6.72 g/L和26.88 g/L的乙酸鈉溶液處理過的菌體形態(tài)如圖2-D、2-E所示。圖2-B顯示，菌體基本形態(tài)沒有較大變化，只出現(xiàn)較小的褶皺，而圖2-C中顯示菌體出現(xiàn)皺縮，菌體的形態(tài)受到較大影響。乙酸鈉處理后的細胞（圖2-D、2-E）顯示，細胞會發(fā)生凹陷，隨著乙酸鈉濃度的增大，細胞受損情況加重。
圖2環(huán)境掃描電子顯微鏡觀察乙酸（鈉）對重組菌形態(tài)結構的影響
2.3對菌體細胞膜通透性的影響
通過測定菌液電導率的變化可以反映細菌細胞膜通透性的變化情況。重組菌經不同濃度的乙酸、乙酸鈉處理后其菌液電導率的變化情況（圖3-A）表明，菌體加入無菌水的空白對照組電導率很低，而且變化不大，而實驗組加入不同濃度的乙酸鈉后，菌液的電導率發(fā)生了不同的變化。乙酸鈉是一種強電解質，強電解質溶液的電導率隨著濃度的增加而升高，當濃度增加到一定程度后，解離度下降，離子運動速率降低，電導率也降低。相同濃度的菌液加入不同濃度的乙酸鈉后，電導率也變得不同，濃度為13.44 g/L時，電導率最大。濃度繼續(xù)升高電導率先降低后升高，可能是由于電解質解離程度高使得乙酸根由于外界壓力進入細胞內部，導致其先下降，而其他濃度的乙酸鈉加入后，會使得電導率有所升高，這說明乙酸根導致了細胞膜的通透性發(fā)生變化，內容物電解質泄露到胞外，其電導率的變化程度相差不大。而圖3-B顯示，加入乙酸后，菌液的電導率均升高，初始電導率隨濃度的增大而增大，升高程度也隨濃度增大而略有增大，說明細胞膜的破壞程度略有增加。
2.4對菌體細胞膜完整性的影響
通過測定經不同處理后的菌液上清在260 nm處的吸光度值變化推測菌體細胞膜的完整性變化情況。重組菌經不同濃度的乙酸（鈉）處理后菌液上清的OD260變化情況（圖4-A）表明，空白對照組的菌液上清OD260沒有升高，且變化較小，而實驗組的OD260變化比較大，且高于對照組，說明實驗組的菌體細胞膜完整性受到影響，有DNA等物質的泄露；由于乙酸鈉是強電解質，濃度太高會抑制其電解率，而濃度為26.88 g/L和6.72 g/L時，趨勢相似，變化程度接近，推測其電解率相近。而濃度為13.44 g/L和3.36 g/L時，OD260值變化不大；濃度為13.44 g/L時，可能是由于乙酸鈉的電離及乙酸根的水解程度較大，會有大量的質子化的乙酸根進入細胞，對膜的完整性影響較小，而濃度為3.36 g/L時，濃度較低則對膜完整性的影響較小。乙酸添加情況（圖4-B）表明，前200 min，變化情況較復雜，無明顯的趨勢，之后可以看到試驗組的OD260高于對照組，且隨濃度增大而升高，說明乙酸會影響菌體細胞膜的完整性，導致DNA等大分子物質的泄露，且隨濃度升高作用增強。
圖3不同濃度乙酸鈉（A）及乙酸（B）對菌體細胞膜通透性的影響
圖4不同濃度乙酸鈉（A）及乙酸（B）對重組菌細胞膜完整性的影響
2.5對細胞內膜的滲透性影響
通過測定菌液上清中的β-半乳糖苷酶的活性，來檢測胞內大分子滲透至胞外的情況，進而說明細胞內膜的受損情況。菌液添加乙酸鈉作用后，離心菌體，取上清測定β-半乳糖苷酶的酶活性，結果（圖5）顯示，加入乙酸鈉作用于菌體后，上清中β-半乳糖苷酶的酶活高于對照組，說明乙酸根對于細胞內膜有一定的破壞作用，導致β-半乳糖苷酶滲漏到胞外，而不同濃度的乙酸鈉對其作用效果相差不大。
2.6熒光分析法測乙酸對菌體膜蛋白構象的影響
通過熒光分析法檢測乙酸對菌體上的膜蛋白及細胞膜結構的影響，結果（圖6）表明，KI作用后，熒光強度降低，說明能與細胞膜表面的蛋白質色氨酸Trp殘基結合，同時熒光強度逐漸降低，由此可以推斷，色氨酸Trp殘基位于細胞膜的表面和內部，當細胞膜結構發(fā)生變化時，膜內部的Trp殘基就會暴露出來與KI結合。圖7結果顯示，隨著乙酸濃度的增大，Trp殘基的熒光強度相應的依次減少，表明乙酸對Trp的熒光特性具有淬滅作用。而激發(fā)峰的位置和圖形基本上沒有變化，這表明乙酸能夠改變細胞膜的結構，使位于細胞膜內的Trp殘基暴露于細胞膜外。
2.7對蛋白質合成的影響
圖8顯示，加入低濃度的乙酸鈉，海藻糖合酶的表達量會增大，推測是由于乙酸根進入胞內，會作為碳源參與到菌體的代謝中，因而其表達量增大，但隨著濃度的繼續(xù)增大，乙酸的抑制作用也會表現(xiàn)出來，海藻糖合酶的表達量則隨著乙酸鈉濃度的增大而減小，說明乙酸鈉會對海藻糖合酶的表達產生抑制。
圖8乙酸鈉作用后的重組菌蛋白SDS-PAGE電泳圖譜
高密度發(fā)酵的過程中乙酸抑制重組大腸桿菌生長及外源基因的表達——摘要
高密度發(fā)酵的過程中乙酸抑制重組大腸桿菌生長及外源基因的表達——材料與方法
高密度發(fā)酵的過程中乙酸抑制重組大腸桿菌生長及外源基因的表達——結果
高密度發(fā)酵的過程中乙酸抑制重組大腸桿菌生長及外源基因的表達——討論、結論
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