噬菌體是一類感染細菌、真菌、放線菌或螺旋體等微生物的病毒，廣泛存在于自然界中。由于噬菌體具有數(shù)量多，體積小，繁殖快和基因組的高度可塑性等特點，使得工業(yè)發(fā)酵過程極易受到噬菌體的感染。噬菌體感染具有普遍性和頑固性，發(fā)酵企業(yè)一旦受到其感染，損失是不可估量的，并且至今仍無應對良策。
大腸埃希氏菌BL21(DE3)是pET系統(tǒng)的常用表達宿主菌，pET系統(tǒng)使用T7啟動子，是有史以來在大腸桿菌中克隆表達重組蛋白的功能最強大的系統(tǒng)，現(xiàn)已作為商品化產(chǎn)品被廣泛應用。BL21(DE3)在工廠和實驗室經(jīng)常受到噬菌體感染，因此防治噬菌體感染問題亟需解決。
在細菌和噬菌體的共同進化過程中，細菌在感染過程中通常攜帶著廣泛的防御系統(tǒng)來防止噬菌體裂解。其中，比較典型且目前常用于基因編輯的CRISPR/Cas9系統(tǒng)于2011年在化膿性鏈球菌中發(fā)現(xiàn)，是一種適應性免疫系統(tǒng)，可以保護細菌和古細菌免受噬菌體或質(zhì)粒等外來遺傳元素的影響。目前人為防治噬菌體感染的常見措施主要包括用各種消毒劑殺滅噬菌體控制感染源、菌株輪換、自然突變篩選抗噬菌體菌株等。其中通過的傳統(tǒng)的基因工程策略以及基于細菌防御系統(tǒng)的噬菌體防治策略方法由于其操作簡單，效果顯著而被廣泛使用。但是目前各個工廠或者實驗室使用的抗噬菌體菌株大多只能抵御某一株或幾株特定噬菌體的感染，能夠抵御未有噬菌體感染的工程菌株依然值得挖掘。
本文對抗噬菌體菌株大腸埃希氏菌BL21-C和BL21-T進行抗噬菌體能力和生長曲線測定，結果表明通過導入以CRIPSR/Cas9系統(tǒng)為抵御系統(tǒng)的元件pPTCS可賦予BL21-C和BL21-T菌株抵御可以裂解BL21(DE3)的短尾類噬菌體侵染的能力，同時也穩(wěn)定維持著親本株的生長情況，說明抵御元件pPTCS的轉入并不會影響菌株的生長。
圖1為親本株BL21(DE3)和抗噬菌體菌株BL21-C、BL21-T感染噬菌體TR1(感染復數(shù)為1)的生長曲線圖。其中，抗噬菌株BL21-C和BL21-T分別測試了在噬菌體TR1感染下有阿拉伯糖誘導和無阿拉伯糖誘導的生長情況。無噬菌體感染設置為對照組。
抗噬菌體菌株BL21-C和BL21-T的生長曲線測定
為測定BL21-C和BL21-T的生長穩(wěn)定性，設置三組實驗：誘導組(噬菌體TR1以感染復數(shù)為1侵染且加入終濃度為0.02g/L的阿拉伯糖誘導抵御元件工作)、不誘導組(噬菌體TR1以感染復數(shù)為1侵染但無阿拉伯糖誘導)和對照組(無噬菌體侵染)。每組實驗設置三組重復。
將BL21(DE3)、BL21-C和BL21-T三株菌株的單克隆分別接種于5mL的LB液體培養(yǎng)基中，其中BL21-C和BL21-T所在培養(yǎng)基中額外加入終濃度為20μg/mL的慶大霉素，誘導組加入終濃度為0.02g/L的阿拉伯糖，在37℃，220rpm的條件下培養(yǎng)至OD600值為0.1后加入噬菌體TR1，該時刻記為0h，隨后每隔1h直至8h取樣200μL測量OD600值并記錄。
結果如圖1所示。從圖中可以看出，誘導組與對照組的BL21-C和BL21-T生長情況與BL21(DE3)的生長情況基本一致，都呈上升狀態(tài)。而未誘導組由于未誘導抵御元件工作，沒有賦予細菌抵御噬菌體的能力，從而導致其受噬菌體的侵染，OD600值的下降。該結果說明通過轉入以CRISPR/Cas9系統(tǒng)為抵御系統(tǒng)的元件，賦予BL21-C和BL21-T菌株抵御噬菌體侵染能力的同時，也穩(wěn)定維持著原本的生長情況，抵御元件的轉入不會影響菌株的生長。