土壤病毒是土壤生物多樣性的重要組成部分，數(shù)量繁多，在調控微生物多樣性、群落組成和養(yǎng)分循環(huán)等方面具有重要的生態(tài)功能。然而，由于土壤自身的復雜性及其動態(tài)變化特征，病毒在土壤生態(tài)系統(tǒng)中發(fā)揮的功能及其作用機理，一直是該研究領域的薄弱環(huán)節(jié)，也是當前土壤生物學、微生態(tài)學和環(huán)境科學等領域的研究熱點和前沿。下面一起來了解下土壤病毒研究常用方法有哪些。
大多數(shù)土壤病毒研究的第一步工作是需要將吸附在土壤顆粒上的病毒粒子進行洗脫浸提，而10%的檸檬酸鉀溶液、10%的牛肉膏、250 mmol/L的甘氨酸溶液和10 mmol/L的焦磷酸鈉溶液為最常用的4種土壤病毒洗脫浸提液，其中對于農(nóng)田土壤病毒洗脫提取，10%的檸檬酸鉀溶液效果相對最佳。
通過比較了3種物理分散方法(振蕩、渦旋和超聲處理)和10種土壤病毒洗脫浸提液，最終確定了從(亞)熱帶紅壤中提取病毒的優(yōu)化方法。此外，為得到高濃度的土壤病毒提取液，還需要對其進行土壤病毒純化及富集。目前最常用的土壤病毒純化及富集方法是聚乙二醇(polyethylene glycol,PEG)沉淀法、CsCl平衡梯度等密度離心法及切向流過濾法(tangential-flow filtration,TFF)。其中，對于土壤病毒粒子的分離、純化及富集主要采用切向流過濾法，其原理是利用蠕動泵將土壤病毒洗脫液勻速流經(jīng)特定孔徑的過濾膜，從而實現(xiàn)土壤病毒提取液的純化及濃縮。
表1土壤典型病毒
在獲取純化及富集后的土壤病毒粒子，可依靠掃描電子顯微鏡(scanning electron microscope,SEM)、透射電子顯微鏡(transmission electron microscope,TEM)和流式細胞儀(flow cytometer,FC)等工具，對其進行計數(shù)及形態(tài)學、生物學特性分析，此外，當前宏病毒組技術也被廣泛應用于土壤病毒研究，屬于研究熱點之一。值得注意的是，由于病毒基因組不同于原核微生物基因組，沒有類似于原核生物16S rRNA基因普遍保守的系統(tǒng)發(fā)育標記，因此難以利用分子生物技術對土壤病毒多樣性和系統(tǒng)發(fā)育進行綜合分析。
當前唯有在特定病毒類群中，才可利用某些高度保守的標記基因評估某個類群中的系統(tǒng)發(fā)育關系(如g23)，但攜帶類似保守基因的病毒只占自然環(huán)境中所有病毒種群的極小比例，不能夠完整地反映環(huán)境中病毒多樣性特征。隨著高通量測序和宏基因組學技術的發(fā)展，人們無須通過宿主培養(yǎng)及單基因標記，僅通過對整個環(huán)境中的病毒基因進行比較分析就可以研究病毒多樣性。宏病毒組主要有兩種分析方法，一是直接收集土壤中的病毒，提取DNA并測序分析。
然而，實驗收集的過程會造成一定程度的病毒損失，且由于土壤病毒基因組含量少，需要通過全基因組擴增病毒基因組以達到可測序濃度，會出現(xiàn)偏好性擴增，這些因素都影響著宏基因組序列信息對土壤病毒多樣性的真實反映；二是從細菌宏基因組中挖掘病毒序列信息。然而，由于細菌基因組的干擾以及土壤病毒基因庫的不完整性，導致土壤病毒的大量序列無法有效注釋。由于這些技術方面的限制，目前通過宏病毒組研究土壤病毒多樣性的報道較少。
此外，也有研究利用病毒指紋圖譜技術來探究土壤病毒多樣性，如利用RAPD-PCR(random PCR amplification of polymorphic DNA)技術發(fā)現(xiàn)南極不同地點土壤病毒群落結構存在顯著差異，且病毒群落結構隨環(huán)境變化而異。
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