活體微生物制劑利用微生物在不同環(huán)境中的自我繁殖能力，在改善微生物群落結(jié)構(gòu)、降低污染、提升土壤地力、促進(jìn)作物生長(zhǎng)和抗病能力等方面發(fā)揮著越來(lái)越重要的作用。
傳統(tǒng)微生物環(huán)境耐受水平分析主要是通過(guò)平板分離獲得對(duì)單克隆菌落數(shù)量的統(tǒng)計(jì)，或通過(guò)試管、搖瓶進(jìn)行微生物培養(yǎng)，再根據(jù)菌體光密度分析其生長(zhǎng)曲線(xiàn)。為了摸索簡(jiǎn)便可行的操作方法，研究人員采用96孔培養(yǎng)板培養(yǎng)微生物，以獲得微生物對(duì)不同抗生素的耐受水平，或?qū)崿F(xiàn)對(duì)功能菌株的高通量篩選，證實(shí)了96孔培養(yǎng)板對(duì)微生物進(jìn)行微量培養(yǎng)的可行性和便利性。
微生物菌懸液的制備
細(xì)菌在LB培養(yǎng)基上劃線(xiàn)純化，挑取單菌落接入10 mL新鮮LB液體培養(yǎng)基中，30℃培養(yǎng)過(guò)夜，備用。鏈霉菌在ISP2固體培養(yǎng)基上28℃劃線(xiàn)純化，挑取單菌落轉(zhuǎn)接新鮮ISP2培養(yǎng)皿28℃培養(yǎng)3～5 d，待孢子長(zhǎng)好，用滅菌不銹鋼稱(chēng)量勺輕輕刮取孢子于適量的含0.5%吐溫-80的水溶液中懸浮，制成孢子懸浮液。
平板分離法檢測(cè)菌株紫外線(xiàn)耐受水平
取1～2 mL菌懸液加入24孔培養(yǎng)板中，置于30 W、254 nm波長(zhǎng)紫外線(xiàn)燈正下方30 cm處分別照射2、5、10、30 min，以未經(jīng)紫外線(xiàn)照射的處理為對(duì)照，每個(gè)處理重復(fù)3次。取1～2 mL鏈霉菌孢子懸浮液加入24孔培養(yǎng)板中，在相同紫外線(xiàn)條件下分別照射10、30、60 min。將紫外線(xiàn)照射后的菌懸液按比例用無(wú)菌水稀釋至合適濃度，并分別取100μL稀釋樣品涂布LB或ISP2平板，每個(gè)稀釋樣品重復(fù)涂布2個(gè)平板，細(xì)菌30℃培養(yǎng)48 h，鏈霉菌28℃培養(yǎng)72 h，統(tǒng)計(jì)菌落數(shù)。
酶標(biāo)儀分光光度法檢測(cè)菌株紫外線(xiàn)耐受水平
菌懸液或孢子懸浮液按1.2.2進(jìn)行紫外線(xiàn)照射后，按2%(體積分?jǐn)?shù))的接種量接入預(yù)先添加200μL/孔LB或ISP2培養(yǎng)液的96孔培養(yǎng)板中，每個(gè)樣品重復(fù)2次。以2%無(wú)菌水接種的培養(yǎng)液做空白對(duì)照。接種完成后在96孔板上貼上一層無(wú)菌專(zhuān)用封膜，再蓋上96孔板蓋，以避免孔內(nèi)培養(yǎng)液在振蕩過(guò)程中濺出互相污染。將96孔板放入微孔板恒溫振蕩器上，細(xì)菌30℃、500 r/min培養(yǎng)2、4、6、8 h，鏈霉菌28℃、500 r/min培養(yǎng)6、12、18、21、24、27 h，用酶標(biāo)儀檢測(cè)各培養(yǎng)液在600 nm的吸光度(OD600)，以時(shí)間為橫坐標(biāo)，以吸光度為縱坐標(biāo)，繪制菌株生長(zhǎng)曲線(xiàn)。
鏈霉菌Ahn30和TJA4經(jīng)紫外線(xiàn)照射后的生長(zhǎng)情況(酶標(biāo)儀分光光度法)
酶標(biāo)儀分光光度法檢測(cè)細(xì)菌的pH耐受水平
將LB培養(yǎng)液用HCl或NaOH調(diào)整pH值分別為4、5、6、7、8、9。在96孔板中加入200μL不同pH值的LB液體，以2%的接種量接入培養(yǎng)過(guò)夜的菌懸液，貼上封膜，并蓋上板蓋，放入微孔板恒溫震蕩器上30℃，700 r/min培養(yǎng)2、4、6、8 h。分別以不同pH值的未接菌培養(yǎng)液做空白對(duì)照，每個(gè)pH重復(fù)6次。用酶標(biāo)儀檢測(cè)各培養(yǎng)液的OD600，并繪制菌株生長(zhǎng)曲線(xiàn)。
酶標(biāo)儀分光光度法檢測(cè)細(xì)菌的鹽耐受水平
配制含1%、3%、5%、7%、9%NaCl的LB培養(yǎng)液。按1.2.4的方法加入培養(yǎng)液和菌懸液并培養(yǎng)，分別以不同鹽濃度的未接菌培養(yǎng)液做空白對(duì)照。用酶標(biāo)儀檢測(cè)各培養(yǎng)液的OD600，繪制不同鹽濃度下菌株的生長(zhǎng)曲線(xiàn)。
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