為篩選出能夠高效降解豆粕碳水化合物和蛋白的菌株，并優(yōu)化菌株發(fā)酵條件。以纖維素酶、果膠酶、木聚糖酶和蛋白酶活力為指標(biāo)，從真菌A-1、A-2、O-1、M-4、Y-11和細(xì)菌KC 6株菌株中篩選出1株產(chǎn)酶豐富的菌株。利用18S rRNA基因序列法鑒定該菌株，通過單因素實(shí)驗(yàn)優(yōu)化菌株的發(fā)酵條件。研究表明：A-1和M-4纖維素酶活力顯著高于其它菌株(P<0.05)，A-2木聚糖酶活力顯著性高于其它菌株(P<0.05)，A-1和A-2果膠酶活力顯著高于其他菌株(P<0.05)，A-1蛋白酶活力顯著高于其它菌株(P<0.05)。綜合比較，選擇A-1作為發(fā)酵豆粕菌株。經(jīng)基因序列鑒定，A-1菌株為泡盛曲霉(Aspergillusawamori)。其最適的發(fā)酵條件為：料水比為1∶1.1，發(fā)酵溫度為31℃，發(fā)酵時(shí)間為37 h，添加的營養(yǎng)因子為2‰K2HPO4、2‰NaCl、2‰(NH4)2SO4、1%葡萄糖、2‰尿素。在此發(fā)酵條件下，豆粕中蛋白質(zhì)含量從50.8%提高到61.7%，可溶性氮指數(shù)(TCA-NSI)從3.9%提高到19.8%，胰蛋白酶抑制因子含量從2 mg/g降到0.4 mg/g以下，水蘇糖含量從32.52 mg/g降到0.39 mg/g，棉籽糖含量從12.09 mg/g降到0.73 mg/g。大豆球蛋白含量從94 mg/g降到1.4 mg/g以下，β-伴球蛋白含量從109.2 mg/g降到2.8 mg/g以下。研究結(jié)果表明：泡盛曲霉能顯著提高豆粕蛋白質(zhì)含量，降低抗?fàn)I養(yǎng)因子，提高豆粕的營養(yǎng)價(jià)值。本研究為利用微生物發(fā)酵豆粕替代魚粉提供了理論基礎(chǔ)。
水產(chǎn)品脂肪含量低、蛋白質(zhì)含量高、營養(yǎng)平衡、味道鮮美。隨著國民生活水平的提高和健康飲食觀念的普及，水產(chǎn)品已成為必不可少的膳食構(gòu)成成分。1989年以來，我國水產(chǎn)品產(chǎn)量已連續(xù)22年居世界首位。為滿足國民對水產(chǎn)品日益增長的需求，我國水產(chǎn)養(yǎng)殖規(guī)模逐年擴(kuò)大，水產(chǎn)品年產(chǎn)量不斷提高。水產(chǎn)養(yǎng)殖離不開魚油和魚粉。水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展導(dǎo)致魚油和魚粉價(jià)格不斷上揚(yáng)。因此，用植物蛋白替代魚粉備受關(guān)注。研究表明，植物蛋白部分替代魚粉是可行的。但是，過量植物蛋白會(huì)急劇降低水生動(dòng)物生長。因此，亟待尋找能媲美魚粉的蛋白源。
豆粕是主要植物蛋白源之一，來源廣，價(jià)格低，易儲(chǔ)存，營養(yǎng)較均衡。用豆粕替代飼料魚粉已有許多研究報(bào)道。豆粕含有大量碳水化合物、胰蛋白酶抑制因子、大豆寡糖、抗原蛋白、植酸、凝集素和大豆皂甙等抗?fàn)I養(yǎng)因子，其在水產(chǎn)飼料特別是天然“糖尿病”的肉食性魚飼料中的應(yīng)用受到限制。肉食性魚不能降解糖類也不耐受糖類，而豆粕含35%左右的碳水化合物。細(xì)胞壁纖維素將豆粕蛋白包裹起來，阻礙了魚類利用蛋白質(zhì)。美國國家研究委員會(huì)(NRC)指出植物蛋白含大量碳水化合物和粗纖維等，肉食性魚類難消化這些組分。豆粕中的抗?fàn)I養(yǎng)因子阻礙魚類消化吸收其營養(yǎng)物質(zhì)。另外，大豆抗原蛋白具有致敏性，易引發(fā)炎癥反應(yīng)。在虹鱒(Oncorhynchusmykiss)和大西洋鮭(Salmosalar)飼料中，高比例豆粕替代魚粉導(dǎo)致腸道炎癥，不同程度損傷黏膜。許多研究表明，微生物發(fā)酵能降低豆粕抗?fàn)I養(yǎng)因子含量、釋放游離氨基酸，改善豆粕營養(yǎng)價(jià)值，提高水產(chǎn)動(dòng)物的飼料利用率。以往的研究發(fā)現(xiàn)豆粕的微生物發(fā)酵不能徹底分解碳水化合物，是豆粕不能高比例替代魚粉的原因之一。本研究篩選高效降解碳水化合物和蛋白質(zhì)的真菌菌株，并優(yōu)化發(fā)酵條件，以降低豆粕碳水化合物含量，提高豆粕蛋白利用率。
1材料與方法
1.1材料
1.1.1微生物菌株
真菌O-1和M-4由本實(shí)驗(yàn)室保藏。真菌A-1和A-2，酵母Y-11和細(xì)菌枯草芽孢桿菌KC由浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)與微生物所保藏。原料豆粕(干物質(zhì)蛋白質(zhì)含量50.8%)由山東六和集團(tuán)有限公司提供。
1.1.2察氏瓊脂培養(yǎng)基
含硝酸鈉(NaNO3)3g，磷酸氫二鉀(K2HPO4)1g，硫酸鎂(MgSO4·7H2O)0.5g，氯化鉀(KCl)0.5g，硫酸亞鐵(FeSO4·7H2O)0.01g，蔗糖30g，瓊脂20g，蒸餾水1000mL，pH值不做調(diào)整，121℃滅菌20min。PDA瓊脂培養(yǎng)基含馬鈴薯(去皮)200g，葡萄糖20g，瓊脂20g，水1000ml，pH值不做調(diào)整，121℃滅菌20min。LB瓊脂培養(yǎng)基含胰蛋白胨(Tryptone)10g/L，酵母提取物(Yeast extract)5g/L，氯化鈉(NaCl)10g/L，瓊脂20g，水1000mL，pH值不做調(diào)整，121℃滅菌20min。菌種擴(kuò)繁培養(yǎng)基含麩皮9g，豆粕1g，K2HPO40.1g，水10mL，pH不做調(diào)整，121℃滅菌20min。豆粕發(fā)酵培養(yǎng)基：豆粕40g，pH不做調(diào)整，121℃滅菌20min。
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