單核細(xì)胞增生李斯特菌，簡(jiǎn)稱單增李斯特菌(Listeria monocytogenes,Lm)，是不形成芽胞的革蘭陽性(G+)短桿菌，具有需氧或兼性厭氧特性，兼性胞內(nèi)寄生，作為一種食源性病原菌(foodborne pathogen)，可導(dǎo)致李斯特菌病(listeriosis)，患者表現(xiàn)為胃腸炎、腦膜炎、敗血癥、流產(chǎn)或死胎等，病死率(case fatality rate)高達(dá)20%?30%[1-3]。Lm能低溫生長(zhǎng)，最低生長(zhǎng)溫度可達(dá)?0.4℃[4]，對(duì)冷藏食品的安全構(gòu)成嚴(yán)重威脅，并對(duì)人類健康造成潛在的危害。目前，Lm低溫生長(zhǎng)的具體機(jī)制不明，研究Lm低溫生長(zhǎng)機(jī)制能為防控李斯特菌病的暴發(fā)提供理論依據(jù)。
Durack等[5]通過分析處于低溫4℃條件下生長(zhǎng)的Lm菌株的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)發(fā)現(xiàn)，與鞭毛合成相關(guān)的基因表達(dá)明顯地下調(diào)，處于被抑制狀態(tài)；運(yùn)動(dòng)性試驗(yàn)結(jié)果顯示，在4℃培養(yǎng)條件下菌株運(yùn)動(dòng)圈的直徑顯著小于25℃培養(yǎng)條件。Cordero等[6]比較了Lm在低溫8℃生長(zhǎng)條件下生長(zhǎng)快的菌株與生長(zhǎng)慢的菌株的運(yùn)動(dòng)性，發(fā)現(xiàn)生長(zhǎng)快的菌株的運(yùn)動(dòng)性顯著弱于生長(zhǎng)慢的菌株；轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)顯示生長(zhǎng)快的菌株的鞭毛合成基因表達(dá)顯著下調(diào)。所以，Lm能低溫生長(zhǎng)與抑制鞭毛基因表達(dá)以減少鞭毛的合成有關(guān)，其具體機(jī)制未見報(bào)道。
Lm鞭毛基因中的flaA是個(gè)單順反子，其編碼鞭毛絲蛋白FlaA，其他鞭毛基因主要分布在394、397和398這3個(gè)操縱元上(圖1)[6-7]。Lm在機(jī)體環(huán)境或37℃培養(yǎng)條件下，鞭毛基因被阻遏蛋白MogR抑制，不產(chǎn)生鞭毛，無運(yùn)動(dòng)性[8-9]；當(dāng)Lm處于外界環(huán)境或20?30℃培養(yǎng)條件時(shí)，MogR被抗阻遏蛋白GmaR抑制，MogR對(duì)鞭毛基因表達(dá)的抑制被解除，Lm合成鞭毛，能運(yùn)動(dòng)[10-11]。因此，我們推斷Lm低溫生長(zhǎng)時(shí)鞭毛量減少可能與MogR抑制鞭毛基因表達(dá)有關(guān)。為了驗(yàn)證此推斷，本文以Lm ATCC 19115為親本株，構(gòu)建阻遏蛋白MogR基因缺失株ΔmogR及其回補(bǔ)株cΔmogR，同時(shí)還構(gòu)建了鞭毛絲蛋白FlaA基因缺失株ΔflaA(作為無鞭毛對(duì)照株)及其回補(bǔ)株cΔflaA，測(cè)定各菌株在低溫下的運(yùn)動(dòng)性、鞭毛形成狀況和鞭毛基因表達(dá)情況，以及測(cè)定所構(gòu)建的菌株在低溫下的生長(zhǎng)情況，以探究MogR對(duì)Lm低溫下鞭毛形成的影響，為闡明Lm低溫生長(zhǎng)機(jī)制提供新的信息。
1材料與方法
1.1菌株、質(zhì)粒和引物
本研究所涉及的細(xì)菌菌株和質(zhì)粒如表1所示。所用引物均由武漢擎科生物科技有限公司合成，引物序列見表2所示。
1.2主要試劑
牛腦心浸出液肉湯(brain heart infusion,BHI)培養(yǎng)基購自青島海博生物技術(shù)有限公司；氨芐青霉素(ampicillin,Amp)和紅霉素(erythromycin,Erm)購自武漢華大至善生物科技有限公司；高保真DNA聚合酶和反轉(zhuǎn)錄試劑盒等購自南京諾唯贊生物科技股份有限公司；T4 DNA連接酶和限制性內(nèi)切酶等購自寶生物工程(大連)有限公司(TaKaRa)；凝膠回收試劑盒和質(zhì)粒提取試劑盒購自O(shè)mega Bio-Tek公司；電鏡負(fù)染液磷鎢酸(phosphotungstic acid,PTA)購自中國科學(xué)院武漢病毒研究所；用于熒光定量PCR的2×T5 Fast qPCR Mix(SYBR Green I)購自武漢擎科生物科技有限公司。
圖1單增李斯特菌鞭毛基因操縱元[6-7]
表1細(xì)菌菌株和質(zhì)粒
1.3缺失株ΔmogR和ΔflaA及其回補(bǔ)株cΔmogR和cΔflaA的構(gòu)建
以ATCC 19115為模板，用引物mogR(L)-F/R和mogR(R)-F/R(表2)擴(kuò)增mogR上下游同源臂(圖2)。Overlap PCR連接上下游同源臂，將同源臂融合產(chǎn)物連接到自殺型溫敏穿梭質(zhì)粒pHT304-ts中，獲得含有mogR上下游同源臂基因的重組質(zhì)粒p2102N。轉(zhuǎn)化p2102N入大腸桿菌DH5α后，由武漢天一輝遠(yuǎn)生物科技有限公司對(duì)p2102N中的同源臂序列進(jìn)行測(cè)序，測(cè)序結(jié)果符合預(yù)期。提取p2102N，電轉(zhuǎn)化(2.4 kV)于ATCC 19115感受態(tài)細(xì)胞，鑒定獲得陽性轉(zhuǎn)化子后，利用同源重組原理篩選，獲得缺失株ΔmogR(圖2)。除用引物flaA(L)-F/R和flaA(R)-F/R(表2)擴(kuò)增flaA上下游同源臂外，缺失株ΔflaA的構(gòu)建方法同ΔmogR。用引物mogR-F/R(表2)擴(kuò)增包括自身啟動(dòng)子的mogR，連接于穿梭載體pHT304，獲得重組質(zhì)粒p2201，對(duì)p2201中的目的基因片段進(jìn)行測(cè)序，提取測(cè)序正確的重組質(zhì)粒電轉(zhuǎn)化入缺失株ΔmogR感受態(tài)細(xì)胞中，PCR鑒定，獲得回補(bǔ)株cΔmogR。除用引物flaA-F/R(表2)擴(kuò)增包括自身啟動(dòng)子的flaA外，回補(bǔ)株cΔflaA的構(gòu)建方法同cΔmogR。
基于全自動(dòng)生長(zhǎng)曲線分析儀研究單增李斯特菌低溫生長(zhǎng)機(jī)制（一）
基于全自動(dòng)生長(zhǎng)曲線分析儀研究單增李斯特菌低溫生長(zhǎng)機(jī)制（二）
基于全自動(dòng)生長(zhǎng)曲線分析儀研究單增李斯特菌低溫生長(zhǎng)機(jī)制（三）
相關(guān)新聞推薦
2、嗜堿鹽單胞菌菌株生理生化與生長(zhǎng)特性、最優(yōu)發(fā)酵條件——結(jié)果與分析
3、桑椹菌核病拮抗菌的分離篩選、鑒定、生防作用與機(jī)理——材料與方法