2.4 mogR的缺失對Lm低溫生長的影響(growth curve)
本研究分別在4、28、37℃條件下培養(yǎng)菌株ATCC 19115、ΔmogR、cΔmogR、ΔflaA和cΔflaA，測定菌液OD600值，繪制生長曲線(圖9)，計算曲線下面積(area under the curve,AUC)(圖10A–10C)和曲線下面積差異(ΔAUC)(圖10D)，以分析鞭毛的產生對Lm低溫生長的影響。
結果顯示，在4℃時，與親本株ATCC 19115相比，缺失株ΔmogR(圖9A)和回補株cΔflaA(圖9B)的生長能力下降，其AUC值分別為13.2和13.5(圖10A)，比親本株的AUC值(14.6)低9.84%和8.07%(P<0.05)(圖10D)；回補株cΔmogR(圖9A)和缺失株ΔflaA(圖9B)在對數期和穩(wěn)定期的生長均高于親本株，其AUC值分別為16.6和20.7(圖10A)，比親本株的AUC值(14.6)高13.67%和41.22%(P<0.01)(圖10D)。在28℃時，5個菌株的生長無顯著性差異(圖9C、圖10B和10D)。5個菌株在37℃時的情況與4℃時的相似(圖9D、圖10C和10D)。結果表明，4℃時MogR對鞭毛合成的抑制作用有助于Lm低溫生長。
圖8ΔmogR和cΔmogR的鞭毛基因fliN、flhB、flgE、fliM、flgK、fliF和fliI在4℃(A)、28℃(B)和37℃(C)條件下相比于親本株ATCC 19115的相對轉錄表達水平
圖9 ATCC 19115、ΔmogR、cΔmogR、ΔflaA和cΔflaA在4℃(A和B)、28℃(C)和37℃(D)條件下的生長曲線
圖10 ATCC 19115、ΔmogR、cΔmogR、ΔflaA和cΔflaA在4℃(A)、28℃(B)和37℃(C)條件下的生長曲線的曲線下面積值和與親本株相比的曲線下面積差異ΔAUC(D)
3討論
3.1低溫下Lm的運動能力和鞭毛表達量不具有血清型特異性
Lm有14個血清型：1/2a、1/2b、1/2c、3a、3b、3c、4a、4ab、4b、4c、4d、4e、7[16]和4h[17]，其中1/2a、1/2b、1/2c和4b是食品和臨床病例中最常分離到的血清型，約占所有血清型的95%[18-19]。本研究選取來自這4個血清型的菌株ATCC 19115(4b)、ATCC 19111(1/2a)、YSP2019032612(1/2b)和Lm210722566(1/2c)，通過運動性試驗和RT-qPCR測定了菌株在4、28、37℃生長時的運動能力和鞭毛基因表達情況，發(fā)現所有菌株4℃時的結果均顯著低于28℃時的結果(P<0.01或P<0.001)，且所有菌株37℃時的結果與4℃時的相似(圖11、圖12)，表明低溫4℃時Lm鞭毛表達低是非血清型特異性的，因此本研究選擇Lm ATCC 19115(4b)菌株為親本株進行了深入的研究。
3.2 MogR的抑制蛋白GmaR在鞭毛基因表達中發(fā)揮作用
Lm在20?30℃條件下，MogR被抗阻遏蛋白GmaR抑制，MogR對鞭毛基因表達的抑制被解除，Lm產生鞭毛[7,10,20]。GmaR是溫度感應蛋白，在37℃時，GmaR單體蛋白凝集在一起，無法與MogR結合，不能發(fā)揮抗阻遏作用，導致MogR抑制鞭毛基因表達；在30℃時，GmaR單體蛋白與MogR結合，使MogR離開鞭毛基因啟動子，從而使鞭毛基因得以表達[11]。本研究結果表明4℃時MogR抑制了Lm鞭毛的形成，說明MogR未被GmaR抑制。那么4℃時GmaR是否如同在37℃時一樣處于單體聚集狀態(tài)，不與MogR結合，不發(fā)揮抗MogR阻遏作用，使MogR發(fā)揮抑制鞭毛基因表達的功能？我們正在進行這方面的探究。
3.3 MogR對Lm鞭毛基因表達的抑制作用與DegU相關
Lm在20?30℃條件下能形成鞭毛，除了GmaR發(fā)揮對MogR的抑制作用外，還需要雙組分系統(tǒng)(HK/RR)中的孤兒RR DegU的正調控作用。DegU結合到fliN-gmaR操縱元(即operon 394)的啟動子區(qū)域以調控gmaR的表達(圖1)，DegU的結合位點不與MogR的結合位點重疊，而且能以非磷酸化形式起作用[7,20-21]。本研究結果表明低溫4℃時MogR對Lm的鞭毛基因表達有抑制作用，說明GmaR未阻遏MogR的作用。那么是否表明，低溫4℃時gmaR的表達未受到DegU的正調控，gmaR沒有表達出GmaR蛋白而無法行使對MogR的阻遏作用？這還有待進一步探究。
圖11 Lm菌株ATCC 19115、ATCC 19111、YSP2019032612和Lm210722566分別在4、28、37℃下的運動能力(A)及運動圈的直徑大小(B)
圖12與28℃相比，4℃和37℃條件下Lm菌株ATCC 19115、ATCC 19111、YSP2019032612和Lm210722566的鞭毛絲蛋白基因flaA的相對表達量
3.4鞭毛的產生與Lm低溫生長的關系
研究發(fā)現，在冷藏溫度4?8℃時，Lm下調鞭毛基因表達量以降低其運動性來維持生長，生長快的菌株的鞭毛基因表達量顯著低于生長慢的菌株，且隨著時間的推移，生長慢的菌株運動性會更強，但未闡明具體機制[5-6]。本研究結果顯示，在4℃時，mogR缺失后，Lm的鞭毛基因轉錄不被抑制，鞭毛基因表達量顯著高于親本株(圖7、圖8)，鞭毛合成量顯著多于親本株(圖5、圖6)，運動性顯著強于親本株(圖4)，生長能力顯著弱于親本株(圖9、圖10)，表明鞭毛的產生會降低Lm在4℃時的生長速率。
4結論
本研究構建了Lm鞭毛基因轉錄阻遏蛋白MogR和鞭毛絲蛋白FlaA的缺失株ΔmogR和ΔflaA，以及相應的回補株cΔmogR和cΔflaA，測定了菌株分別在4、28、37℃時的運動性、鞭毛產生情況和鞭毛基因表達量，結果表明Lm在4℃時鞭毛產量少與MogR的抑制作用有關；本研究測定了菌株分別在4、28、37℃時的生長曲線，通過分析發(fā)現，在低溫條件下Lm能生長繁殖與MogR對鞭毛基因表達的抑制作用有關。本研究為揭示Lm低溫生長機制提供了新的信息。
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