摘要
生物膜通常是導(dǎo)致人類慢性感染和污染工業(yè)或醫(yī)療設(shè)備的原因。傳統(tǒng)的方法是使用濃度越來越高的抗生素，但微生物會(huì)迅速對(duì)其產(chǎn)生多重耐藥性。因此，我們研究了使用天然物質(zhì)作為替代解決方案。使用配備圖像分析軟件的Cellavista自動(dòng)顯微鏡測(cè)量基于定殖區(qū)域的生物膜定量。Cellavista設(shè)備的使用為固定細(xì)胞的鑒定和量化帶來了新的可能性。在我們的研究中，通過探索兩性霉素B、黃芩素、殼聚糖和松蘿酸對(duì)酵母生物膜形成的抗真菌/抗生物膜活性，證實(shí)了這一特征。在96孔聚苯乙烯微滴度板上研究了這些物質(zhì)對(duì)機(jī)會(huì)致病性假絲酵母和克魯西假絲酵母生物膜形成和根除的影響。雖然兩性霉素B不是很有效，但黃芩素和殼聚糖的使用，即使是在最低抑制濃度下，也能迅速減少井中的定殖面積。松蘿酸即使在濃度為300μg ml時(shí)也沒有顯示出任何顯著的抗生物膜特性?1、我們的研究結(jié)果表明，Cellavista是研究酵母生物膜形成和抗菌劑作用的一個(gè)很有前景的工具。
1、簡(jiǎn)介
生物膜是高度組織化的基質(zhì)封閉微生物群落，它們不可逆地附著在表面、相界面或彼此之間。這些微生物群落經(jīng)常污染醫(yī)療器械或工業(yè)設(shè)備，并引起廣泛的人類感染。治療這些感染的巨大問題是生物膜對(duì)常用抗生素的高度耐藥性。生物膜中的微生物比浮游細(xì)胞更具抵抗力（高達(dá)1000倍）（Thebault等人，2013年）。
自然界中幾乎99%的微生物能夠以生物膜的形式生長(zhǎng)，并在生物膜中定居在各種表面（Thebault et al.，2013）。細(xì)菌生物膜及其相關(guān)感染通常比其他微生物引起的生物膜得到更廣泛的研究。然而，酵母生物膜，尤其是念珠菌屬生物膜，也可導(dǎo)致人類嚴(yán)重感染（Trofa等人，2008年，Pires等人，2011年）。
念珠菌是醫(yī)院感染或醫(yī)療器械上形成的生物膜中最常見的分離酵母菌之一。白色念珠菌通常被指定為最廣泛的機(jī)會(huì)性致病酵母，但副Silosis念珠菌、熱帶念珠菌、光滑念珠菌和krusei念珠菌也成為許多研究中日益關(guān)注的主題（Kuhn et al.，2002，Gacser et al.，2007，Estivill et al.，2011）。C、副筒倉(cāng)病可導(dǎo)致多種疾病，尤其是免疫缺陷患者。這些疾病包括真菌血癥、心內(nèi)膜炎、腦膜炎、關(guān)節(jié)炎、眼部感染、外陰陰道炎、尿路感染和關(guān)節(jié)疾?。═rofa等人，2008）。雖然一些副硅藻酸桿菌菌株對(duì)多烯類抗菌劑（如兩性霉素B、氟康唑）敏感，但其他菌株已經(jīng)具有耐藥性（van Asbeck等人，2009）。C、krusei被認(rèn)為比其他念珠菌致病性低，但疏水性更強(qiáng)。該因子在導(dǎo)致宿主表面定植的初始事件中起著重要作用。在這種情況下，這種酵母能夠引起一系列臨床表現(xiàn)，如真菌血癥、眼內(nèi)炎、關(guān)節(jié)炎和心內(nèi)膜炎（Samaranayake和Samaranayake，1994）。
目前仍廣泛用于抗真菌感染的抗生素是多烯類抗生素兩性霉素B，盡管它有相當(dāng)嚴(yán)重的副作用。其中最嚴(yán)重的是腎毒性，可能導(dǎo)致腎衰竭（Karimzadeh等人，2013年）。
因此，人們的注意力轉(zhuǎn)向使用具有抗菌、抗真菌和抗生物膜特性的天然物質(zhì)，這可能有助于治療酵母生物膜感染。這些物質(zhì)可以在低濃度下使用，對(duì)患者沒有負(fù)面影響，也不會(huì)產(chǎn)生耐藥性。此類天然物質(zhì)的示例包括多酚、類黃酮、二苯乙烯、萜烯、多糖和常用香料的活性化合物（Rezanka et al.，2012）。例如，黃芩素，一種從黃芩中提取的類黃酮，具有抗氧化、神經(jīng)保護(hù)、抗菌、抗病毒和抗真菌特性（Cao等人，2008）。殼聚糖是一種親水性生物聚合物，是一種存在于甲殼類動(dòng)物外殼中的多糖，具有廣泛的抗菌活性（Martinez et al.，2010）。松蘿酸是地衣的次生代謝產(chǎn)物，具有抗病毒、抗瘧原蟲、抗增殖、抗炎和鎮(zhèn)痛作用（Pires et al.，2012）。
各種各樣的顯微技術(shù)被用來研究生物膜。這些方法包括光學(xué)顯微鏡、掃描激光共聚焦顯微鏡、掃描和透射電子顯微鏡、原子力顯微鏡等（McLean等人，2004）。光學(xué)顯微鏡與圖像分析相結(jié)合，將生物膜視為被粘附細(xì)胞覆蓋的二維區(qū)域，被認(rèn)為是生物膜觀察的基本方法。光學(xué)顯微鏡和圖像分析的結(jié)合已用于評(píng)估附著細(xì)胞的數(shù)量、面積覆蓋率、次要應(yīng)用，包括測(cè)定附著細(xì)胞的生物體積以及實(shí)時(shí)觀察細(xì)菌粘附和生物膜生長(zhǎng)（An&Friedman，1997）。
本文的目的是報(bào)道以一種新的方式應(yīng)用Cellavista裝置研究酵母生物膜及其對(duì)抗菌劑反應(yīng)的可能性。通過觀察用天然物質(zhì)代替抗生素處理真菌生物膜，證明了該方法的應(yīng)用。自動(dòng)顯微鏡Cellavista在生物膜分析中的優(yōu)勢(shì)之一是可以自動(dòng)耦合單個(gè)圖片和這些大表面的后續(xù)圖像分析。一方面，通過消除生物膜的自然可變性，另一方面，由于生物膜環(huán)境中存在天然物質(zhì)，不同生物膜布置的檢測(cè)也會(huì)發(fā)生變化，從而可以顯著改善最終結(jié)果。利用Cellavista設(shè)備提供的圖像分析，我們顯示了黃芩素、殼聚糖和松蘿酸在治療副硅藻菌和克魯西弧菌生物膜方面的積極作用，并將這種治療與兩性霉素B的效果進(jìn)行了比較，從而證明Cellavista可以作為一種快速、可靠的工具，用于確定抗菌劑對(duì)生物膜的有效性。
2、方法
2.1.真菌菌株和生長(zhǎng)培養(yǎng)基
C、布拉格大學(xué)微生物學(xué)研究所提供的副硅藻DBM 2165和C.krusei DBM 2163。庫(kù)存培養(yǎng)物儲(chǔ)存于?70°C，每次實(shí)驗(yàn)前在30°C的麥芽提取物培養(yǎng)基（ME）中進(jìn)行有氧預(yù)培養(yǎng)。試驗(yàn)也在麥芽提取物生長(zhǎng)培養(yǎng)基中進(jìn)行。
2.2.抗真菌藥物
黃芩素、殼聚糖、松蘿酸和兩性霉素B購(gòu)自Sigma Aldrich。黃芩素和松蘿酸溶解在二甲基亞砜中（在所有試驗(yàn)中，培養(yǎng)基中二甲基亞砜的最終濃度均高達(dá)1%），濃度分別為0.004和0.03μg ml?1、殼聚糖的制備方法是將其溶解在少量乙酸中（最大為總體積的2%），然后將其溶解在無菌蒸餾水中，濃度為0.073μg l?將兩性霉素B溶解在無菌蒸餾水中，濃度為0.029μg l?1、每種物質(zhì)在4°C下儲(chǔ)存直至使用（最多一周）。
2.3.抗真菌活性
根據(jù)Sharma et al.（2010），通過微量稀釋法測(cè)定黃芩素、殼聚糖、松蘿酸和兩性霉素B的最小抑制濃度（MIC）。使用Bioscreen C analyzer（Oy Growth Curves Ab Ltd.，芬蘭）通過監(jiān)測(cè)光密度（ODwideband=420–580 nm），在100孔微量滴定板中進(jìn)行培養(yǎng)。將體積為30μl的酵母標(biāo)準(zhǔn)細(xì)胞懸浮液（OD600 nm=0.1）添加到每個(gè)培養(yǎng)皿孔中。包括無藥物和無酵母對(duì)照組。平板在30°C下孵育24小時(shí)。根據(jù)Andrews，2001的定義，MIC被指定為孵育過夜后不允許可見生長(zhǎng)的最低濃度。對(duì)每個(gè)濃度的五個(gè)重復(fù)井進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。
2.4.生物膜形成
副硅藻和克魯西梭菌生物膜是在商用預(yù)消毒聚苯乙烯平底96孔微孔板（firma）上形成的。向每個(gè)培養(yǎng)皿孔中添加210μl生長(zhǎng)培養(yǎng)基中酵母的標(biāo)準(zhǔn)細(xì)胞懸浮液（OD600 nm=0.8）和70μl ME。對(duì)每種濃度的16個(gè)重復(fù)井進(jìn)行了實(shí)驗(yàn)。
2.5.抗粘連藥物效率
為了研究天然物質(zhì)或抗生素對(duì)初始細(xì)胞粘附的影響，從一開始就將其中一種物質(zhì)與酵母的標(biāo)準(zhǔn)細(xì)胞懸浮液一起添加到孔中。將微量滴定板蓋上蓋子，并在30°C、150 rpm下培養(yǎng)24小時(shí)。
2.6.抑制生物膜形成的藥物效率
為了研究天然物質(zhì)或抗生素對(duì)生物膜形成的影響，將含有標(biāo)準(zhǔn)酵母懸浮液的微量滴定板培養(yǎng)24小時(shí)，然后添加其中一種物質(zhì)。在添加藥物之前，不清洗微孔，以模擬物質(zhì)與粘附細(xì)胞和懸浮細(xì)胞相互作用的自然作用機(jī)制條件。將微量滴定板蓋上蓋子，并在30°C、150 rpm下培養(yǎng)24小時(shí)。
2.7.預(yù)形成生物膜的藥物效率
為了研究天然物質(zhì)或抗生素對(duì)清除預(yù)先形成的生物膜的影響，將帶有酵母標(biāo)準(zhǔn)細(xì)胞懸浮液的微量滴定板培養(yǎng)24小時(shí)，然后用鹽水沖洗每個(gè)孔三次。然后，向每個(gè)孔中添加一種溶解在ME中的適當(dāng)濃度的物質(zhì)，并進(jìn)行額外的24小時(shí)培養(yǎng)。用蓋子覆蓋微量滴定板，并在30°C、150 rpm下培養(yǎng)24小時(shí)。
2.8.Cellavista設(shè)備
Cellavista是一種全自動(dòng)細(xì)胞成像儀，具有亮場(chǎng)和三個(gè)熒光通道（標(biāo)準(zhǔn)集包括七個(gè)激發(fā)波長(zhǎng)以及相應(yīng)的濾光片）。該光學(xué)系統(tǒng)由四個(gè)透鏡組成：2×、4×、10×、20×和40×以及一個(gè)提供4 Mpixel圖像的CCD相機(jī)。Cellavista可以評(píng)估6-384個(gè)微孔板、培養(yǎng)皿和顯微鏡載玻片。
可以使用一系列預(yù)定義的應(yīng)用程序（細(xì)胞融合、懸浮細(xì)胞計(jì)數(shù)、細(xì)胞核等）。每個(gè)分析都提供相關(guān)的圖像處理算法，該算法由算法評(píng)估的特定對(duì)象類型定義。用戶可以為每個(gè)分析修改參數(shù)評(píng)估設(shè)置。
為了獲得圖像，將微孔板放入設(shè)備中，可以手動(dòng)調(diào)整正確的圖像設(shè)置（曝光、時(shí)間、光強(qiáng)、增益、焦距）。然后掃描選定的微孔板孔，圖像自動(dòng)耦合，生成整個(gè)孔的圖像。根據(jù)選定的分析和用戶定義的參數(shù)，圖像分析然后通過Cellavista評(píng)估算法對(duì)每個(gè)分析進(jìn)行自動(dòng)和一致的閾值處理。根據(jù)分析類型，可以為圖像分析設(shè)置不同的參數(shù)：例如細(xì)胞數(shù)量、細(xì)胞融合、細(xì)胞或菌落大小和形態(tài)以及熒光應(yīng)用中的熒光強(qiáng)度。該設(shè)備還提供了模板功能，允許對(duì)具有相同布局的實(shí)驗(yàn)進(jìn)行一致評(píng)估，而無需手動(dòng)調(diào)整。對(duì)于每個(gè)單元，以二值圖像形式顯示的結(jié)果（評(píng)估對(duì)象突出顯示），可以將其視為所有圖像的馬賽克（見圖1，描述為時(shí)間過程）。對(duì)于96孔板，每個(gè)孔可拍攝的最大圖像數(shù)量如表1所示。
表1 Cellavista 96孔微孔板每孔圖像數(shù)。
2.9.使用Cellavista設(shè)備評(píng)估藥物療效
為了評(píng)估黃芩素、殼聚糖、松蘿酸或兩性霉素B對(duì)酵母生物膜形成不同階段的影響，將制備的96孔微量滴定板（瑞士TPP AG）的每個(gè)孔用鹽水沖洗三次，然后插入Cellavista自動(dòng)顯微鏡，其中每個(gè)孔底部中心拍攝25張照片（20×物鏡）。這些圖像由Cellavista圖像分析軟件評(píng)估，并確定參數(shù)：對(duì)比度、最小區(qū)域亮度、強(qiáng)度、靈敏度和大小。將天然物質(zhì)或抗生素對(duì)生物膜形成的影響與陰性對(duì)照（無藥物培養(yǎng)）進(jìn)行比較。所有實(shí)驗(yàn)中的對(duì)照組均被指定為100%，以便直接比較研究物質(zhì)的影響
圖1：。評(píng)估Cellavista設(shè)備獲得的生物膜圖像的時(shí)間過程（12小時(shí)、18小時(shí)和24小時(shí)）。（A）從一口井中的生物膜中無梗細(xì)胞的所有原生圖像中剪下馬賽克。（B）同一井的評(píng)價(jià)二值圖像；黑色區(qū)域表示粘附細(xì)胞定植的區(qū)域。比例尺=400μm。
2.10.統(tǒng)計(jì)分析
通過單因素方差分析（ANOVA）和Tukey的HSD檢驗(yàn)，確定了對(duì)照組和物質(zhì)有效性之間在粘附抑制、生物膜發(fā)育和形成生物膜方面的差異的顯著性。
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