1.4運(yùn)動性試驗(yàn)
挑取親本株ATCC 19115、缺失株ΔmogR和ΔflaA，以及回補(bǔ)株cΔmogR和cΔflaA單菌落接種于BHI液體培養(yǎng)基中，37℃、200 r/min培養(yǎng)12 h，隨后1:100轉(zhuǎn)接至新鮮BHI液體培養(yǎng)基中，37℃、200 r/min下培養(yǎng)至OD600為1.0。取5μL菌液穿刺接種于BHI軟瓊脂(0.375%)平板，分別于4℃培養(yǎng)20 d、28℃培養(yǎng)48 h和37℃培養(yǎng)48 h，測量運(yùn)動圈直徑。每株菌3個(gè)重復(fù)，試驗(yàn)進(jìn)行2次，用GraphPad Prism 8進(jìn)行統(tǒng)計(jì)和數(shù)據(jù)可視化。
1.5透射電鏡(transmission electron microscope,TEM)觀察
將菌株ATCC 19115、ΔmogR、ΔflaA、cΔmogR和cΔflaA分別于4、28、37℃下培養(yǎng)至對數(shù)期，然后各取1 mL菌液于1.5 mL EP管中，2 000 r/min離心10 min，菌體沉淀經(jīng)過1 mL 1×PBS洗滌后再用1 mL 1×PBS重懸，即制成TEM試驗(yàn)樣品。取樣品、超純水和PTA染液各20μL滴于冷卻的封口膜上，將銅網(wǎng)扣在樣品液滴上吸附1 min，濾紙吸去多余液體后再扣于超純水液滴上并立即用濾紙吸干，再將銅網(wǎng)扣于PTA染液上染色1 min，用濾紙吸干，待銅網(wǎng)自然干燥后即可用TEM觀察菌體鞭毛生長情況。統(tǒng)計(jì)單位樣品菌量中至少含有一根鞭毛的菌株的百分比，用GraphPad Prism 8進(jìn)行數(shù)據(jù)可視化。
表2本研究所用引物
1.6 RT-qPCR
提取分別在4、28、37℃條件下培養(yǎng)至對數(shù)期的ATCC 19115、ΔmogR、ΔflaA、cΔmogR和cΔflaA菌體RNA，用反轉(zhuǎn)錄試劑盒進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，獲得的產(chǎn)物cDNA即為RT-qPCR的模板。按照2×T5 Fast qPCR Mix(SYBR Green I)試劑說明書對鞭毛合成基因flaA、fliN、flhB、flgE、fliM、flgK、fliF和fliI及16S rRNA基因(作為內(nèi)參基因)進(jìn)行RT-qPCR。用2???Ct相對定量法對結(jié)果進(jìn)行表達(dá)差異性分析。
圖2缺失株ΔmogR構(gòu)建流程圖
1.7生長曲線測定
挑取ATCC 19115、ΔmogR、cΔmogR、ΔflaA和cΔflaA單菌落接種于BHI液體培養(yǎng)基，37℃、200 r/min培養(yǎng)12 h，然后按1:100接種量轉(zhuǎn)接至新鮮BHI液體培養(yǎng)基中，37℃、200 r/min培養(yǎng)至OD600為1.0后按1:100接種量轉(zhuǎn)接于BHI液體培養(yǎng)基中，然后分別進(jìn)行生長曲線測定。(1)4℃生長曲線測定：置菌液于4℃冰箱中靜置培養(yǎng)，每隔1 d測定OD600值；(2)28℃生長曲線測定：把菌液轉(zhuǎn)接至96孔蜂窩板，將蜂窩板置于全自動生長曲線分析儀，設(shè)置培養(yǎng)溫度和時(shí)間，每隔1 h測定OD600值；(3)37℃生長曲線測定同28℃的測定。用GraphPad Prism 8繪制生長曲線。
2結(jié)果與分析
2.1低溫下MogR對Lm運(yùn)動能力的影響(swarming)
在4℃和37℃培養(yǎng)條件下，缺失株ΔmogR的運(yùn)動圈明顯大于親本株(圖3、圖4)，且隨著時(shí)間的延長，ΔmogR與親本株的運(yùn)動性存在顯著性差異(P<0.01)(圖4)。cΔmogR、ΔflaA和cΔflaA在4℃和37℃條件下均與親本株一樣無明顯運(yùn)動圈(圖3、圖4)。在28℃條件下，僅ΔflaA無運(yùn)動性，其他菌株均有明顯運(yùn)動圈(圖3、圖4)。結(jié)果表明，MogR在4℃時(shí)對鞭毛基因表達(dá)有抑制作用，從而降低了Lm的運(yùn)動性。
圖3菌株ATCC 19115、ΔmogR、cΔmogR、ΔflaA和cΔflaA分別在4、28、37℃下的運(yùn)動能力
圖4菌株ATCC 19115、ΔmogR、cΔmogR、ΔflaA和cΔflaA分別在4℃(A)、28℃(B)和37℃(C)下的運(yùn)動圈直徑大小
2.2低溫下MogR對Lm鞭毛合成的影響(TEM)
TEM結(jié)果顯示，在4℃條件下，缺失株ΔmogR含鞭毛菌株比例高于親本株ATCC 19115(圖5)。統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果表明，在4℃和37℃條件下，ΔmogR鞭毛數(shù)量均顯著高于親本株(P<0.001)，回補(bǔ)株cΔmogR鞭毛量與親本株無顯著性差異(圖6A、6C)；在28℃條件下，ΔmogR和cΔmogR鞭毛數(shù)量與親本株無顯著性差異(圖6B)。在4、28、37℃三個(gè)溫度條件下，缺失株ΔflaA均未產(chǎn)生鞭毛，回補(bǔ)株cΔflaA鞭毛量均與親本株無顯著差異(圖5、圖6)。親本株在4℃時(shí)有少量鞭毛產(chǎn)生，但其數(shù)量顯著低于28℃時(shí)的數(shù)量(P<0.001)(圖6D)。ΔmogR鞭毛量在3個(gè)溫度下無顯著性差異(圖6D)。TEM結(jié)果表明，在4℃條件下，MogR對Lm鞭毛的產(chǎn)生有抑制作用。
圖5透射電鏡(TEM)下觀察到的菌株ATCC 19115、ΔmogR、cΔmogR、ΔflaA和cΔflaA分別在4、28、37℃時(shí)的鞭毛生長情況顯示在圖像下方的數(shù)值是單位樣品菌量中至少含有一根鞭毛的菌株的百分比
2.3低溫下MogR對Lm鞭毛基因表達(dá)的影響(RT-qPCR)
首先測定了4、28、37℃條件下ATCC 19115、ΔmogR、ΔflaA、cΔmogR和cΔflaA的鞭毛絲蛋白基因flaA的轉(zhuǎn)錄表達(dá)水平(圖7)。在4℃時(shí)，與親本株ATCC 19115相比，缺失株ΔmogR的flaA表達(dá)量極其顯著上調(diào)(P<0.001)，回補(bǔ)株cΔmogR的flaA表達(dá)量則無顯著性差異(圖7A)；缺失株ΔflaA的flaA表達(dá)量為0，其回補(bǔ)株cΔflaA有flaA表達(dá)(圖7A)，表明缺失株和回補(bǔ)株構(gòu)建成功。溫度之間的比較結(jié)果顯示：缺失株ΔmogR在4℃和37℃時(shí)的flaA表達(dá)量與28℃時(shí)的相比無顯著性差異(圖7B)，即mogR缺失后，菌株在不同溫度下的flaA表達(dá)量不存在差異性；親本株ATCC 19115和回補(bǔ)株cΔmogR在4℃和37℃時(shí)flaA表達(dá)量均顯著低于28℃時(shí)的表達(dá)量(親本株的4℃與28℃相比P<0.01，其余均為P<0.001)(圖7B)。結(jié)果表明，在低溫4℃時(shí)，MogR抑制了Lm鞭毛絲蛋白基因flaA的轉(zhuǎn)錄表達(dá)。
圖6通過TEM觀察的菌株ATCC 19115、ΔmogR、cΔmogR、ΔflaA和cΔflaA分別在4℃(A)、28℃(B)和37℃(C)時(shí)的單位樣品菌量中至少含有一根鞭毛的菌株的百分比柱狀圖及同一菌株在不同溫度下的菌株的百分比柱狀圖(D)
除flaA外，本研究根據(jù)Lm鞭毛蛋白的功能及其基因在操縱元上的分布(圖1)，還選擇fliN、flhB、flgE、fliM、flgK、fliF和fliI這7個(gè)鞭毛基因(表3)進(jìn)行了在4、28、37℃條件下在缺失株ΔmogR、回補(bǔ)株cΔmogR和親本株ATCC 19115中的轉(zhuǎn)錄表達(dá)水平的測定。結(jié)果顯示，4℃時(shí)，ΔmogR的7個(gè)鞭毛基因表達(dá)量顯著高于親本株(P<0.01或P<0.001)，cΔmogR的與親本株的無顯著性差異(圖8A)；28℃時(shí)，ΔmogR和cΔmogR的7個(gè)鞭毛基因表達(dá)量與親本株的均無顯著性差異(圖8B)；37℃與4℃的情況相似(圖8C)。結(jié)果表明，4℃時(shí)MogR對鞭毛操縱元上的基因表達(dá)均有抑制作用。
RT-qPCR結(jié)果與運(yùn)動性結(jié)果和TEM結(jié)果相對應(yīng)，表明MogR低溫4℃時(shí)，同在37℃時(shí)一樣，抑制了鞭毛基因的表達(dá)。
圖7鞭毛絲蛋白基因flaA的轉(zhuǎn)錄表達(dá)水平A：4℃條件下與親本株ATCC 19115相比，ΔmogR、cΔmogR、ΔflaA和cΔflaA的flaA的相對表達(dá)量.B：與28℃相比，4℃和37℃條件下ATCC 19115、ΔmogR和cΔmogR的flaA的相對表達(dá)量
表3本研究選擇的8個(gè)單增李斯特菌鞭毛基因的信息
基于全自動生長曲線分析儀研究單增李斯特菌低溫生長機(jī)制（一）
基于全自動生長曲線分析儀研究單增李斯特菌低溫生長機(jī)制（二）
基于全自動生長曲線分析儀研究單增李斯特菌低溫生長機(jī)制（三）
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