1材料與方法
1.1材料
1.1.1菌株、質(zhì)粒和引物本研究用到的菌株、質(zhì)粒和引物分別見表1和表2。大腸桿菌DH5α用于質(zhì)粒載體的構(gòu)建和擴(kuò)增,并用作lac Z基因的供體;酵母菌株W303-1A和An-a用作親本菌株,酵母菌株WC用作特定核酸序列片段的供體。菌株WC在前期工作中從菌株W303-1A構(gòu)建,其染色體LEU2基因ORF內(nèi)第443到第445位的三個(gè)堿基被刪除,同時(shí)代替插入了片段UPRE-mCherry。此片段全長1 215bp,含有如下元件:Sal I酶切位點(diǎn);26bp未折疊蛋白質(zhì)應(yīng)答元件(unfolded protein response element,UPRE)堿基序列5'-AGGAACTGGACAGCGTGTCGAAAAAG-3';CYC1基因起始密碼子上游250bp序列(簡稱Pcyc1);711bp mCherry ORF序列;216bp ADH I基因終止子序列(簡稱TadhI);BamH I酶切位點(diǎn)。當(dāng)將此片段中基因mCherry替換為lac Z時(shí),片段名稱相應(yīng)變?yōu)閁PRE-lac Z。
表1實(shí)驗(yàn)所用菌株和質(zhì)粒
表2實(shí)驗(yàn)所用引物
1.1.2培養(yǎng)基和生長條件大腸桿菌用培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件:(1)Luria-Bertani(LB)培養(yǎng)基(g/L):酵母抽提物5,胰化蛋白胨10,NaCl 10,pH 7.0,固體培養(yǎng)基則還需添加瓊脂粉15,用于轉(zhuǎn)化子篩選時(shí)添加氨芐青霉素至終濃度100mg/L(簡稱為LB+Ap100平板);(2)培養(yǎng)條件:固體為37℃培養(yǎng)箱倒置;液體為37℃、240r/min。
酵母用培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件:培養(yǎng)基有:(1)YPD培養(yǎng)基、CMG完全基本培養(yǎng)基、篩選用培養(yǎng)基CMG-URA、CMG-URA+HyB和反選用5'-乳清酸(簡稱5'-FOA)平板,均參見陸海燕等人文獻(xiàn)[20],HyB為潮霉素B的簡稱;(2)YPC培養(yǎng)基:碳源為纖維二糖,余同YPD;(3)衣霉素誘導(dǎo)劑顯色篩選平板YPD+Tm+X-Gal:在YPD固體培養(yǎng)基中添加衣霉素(tunicamycin,Tm),使其終濃度為1μg/ml;添加5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷(X-gal),使其終濃度為40μg/ml。培養(yǎng)條件:固體為30℃培養(yǎng)箱倒置;液體為30℃、220r/min。
1.1.3主要試劑和儀器主要試劑:鮭魚精DNA購自美國Clontech公司,LiAC、PEG4000購自美國Sigma公司,內(nèi)切酶、DNA Marker、Taq等工具酶購自大連Takara公司,其余實(shí)驗(yàn)所需試劑均購自上海生工技術(shù)有限公司。瓊脂糖凝膠片段回收試劑盒以及質(zhì)粒抽提試劑盒購自美國Omega公司。無縫重組試劑盒購自諾唯贊公司。引物合成及序列測定由北京奧科生物技術(shù)公司完成。主要儀器有:紫外分光光度計(jì)(美國Unico公司),PCR儀(德國Biometra公司),恒溫培養(yǎng)箱(德國Memmert公司)。
1.2質(zhì)粒構(gòu)建
以pRS42H-gRNA為出發(fā)材料構(gòu)建得到pRS42H-gLEU2(見表1)的流程,概述如下:(1)制備pRS42H-gRNA PCR產(chǎn)物:以質(zhì)粒pRS42H-gRNA的Not I酶切線性化片段為PCR擴(kuò)增模板,使用引物對(duì)P1和P2(見表2)進(jìn)行擴(kuò)增,反應(yīng)條件為:95℃5min,94℃30sec,52℃30sec,72℃5min,循環(huán)30次,末次72℃延伸10min;(2)連接和轉(zhuǎn)化:將(1)所得片段使用諾唯贊公司的無縫重組試劑盒按說明書進(jìn)行首尾連接,然后轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞,用LB+Amp100平板進(jìn)行篩選;(3)轉(zhuǎn)化子鑒定:LB+Amp100平板生長菌落接種LB+Amp100液體培養(yǎng)基過夜培養(yǎng),用CTAB法提取質(zhì)粒,對(duì)質(zhì)粒提取物進(jìn)行酶切鑒定和測序。
1.3 Donor DNA合成
分別以表1中菌株WC、DH5α和WC基因組DNA為模板,使用表2所示三對(duì)引物對(duì)P3/P4、P5/P6、P7/P8進(jìn)行三個(gè)片段的擴(kuò)增:含元件H1和UPRE的PCR1片段;含元件LacZ ORF的PCR3片段;含元件TadhI和H2的PCR2片段。分別以PCR1和PCR3為模板,使用引物對(duì)P3、P6進(jìn)行第一輪重疊交叉延伸PCR反應(yīng),產(chǎn)物命名為PCR13,預(yù)期長度3 439bp;以PCR13和PCR2為模板,使用引物對(duì)P3、P8進(jìn)行第二輪重疊交叉延伸PCR反應(yīng),產(chǎn)物命名為PCR123,預(yù)期長度3 721bp。PCR反應(yīng)條件為:95℃5min,94℃30sec,(52~56)℃30sec,72℃(1~5)min,循環(huán)30次,末次72℃延伸10min。
1.4釀酒酵母感受態(tài)細(xì)胞的制備及轉(zhuǎn)化
按文獻(xiàn)中的方法制備感受態(tài)細(xì)胞并進(jìn)行轉(zhuǎn)化、篩選和鑒定,具體如下:(1)YCplac33-Cas9轉(zhuǎn)化:表1質(zhì)粒YCplac33-Cas9轉(zhuǎn)化菌株W303-1A和An-a感受態(tài)細(xì)胞,利用CM'G-URA平板進(jìn)行篩選,得到W303-1A(YCplac33-Cas9)和An-a(YCplac33-Cas9);(2)指示菌株構(gòu)建:制備菌株W303-1A(YCplac33-Cas9)和An-a(YCplac33-Cas9)感受態(tài)細(xì)胞,將質(zhì)粒pRS42H-gLEU2和donor DNA片段共轉(zhuǎn)化,利用(CM'G-URA+HyB)平板篩選,生長菌落復(fù)制到(CM'G-URA+HyB)平板復(fù)篩,進(jìn)一步點(diǎn)接到平板YPD+Tm+X-Gal進(jìn)行顯色,呈現(xiàn)藍(lán)色者接種液體培養(yǎng)、提取染色體DNA,然后進(jìn)行菌落PCR鑒定及PCR產(chǎn)物測序。PCR鑒定引物對(duì)為P9、P10。測序?yàn)轭A(yù)期序列者進(jìn)一步進(jìn)行5'-FOA平板反選,以篩選得到質(zhì)粒YCplac33-Cas9丟失的陽性轉(zhuǎn)化子菌株。
質(zhì)粒BG的轉(zhuǎn)化方法同YCplac33-Cas9轉(zhuǎn)化。
1.5生長評(píng)價(jià)
挑取固體培養(yǎng)基平板上新鮮生長的菌落,接入裝有5ml YPD培養(yǎng)液的試管中,30℃、220r/min培養(yǎng)過夜,轉(zhuǎn)接進(jìn)行二次液體培養(yǎng),所得菌液為種子液;接種到裝有50ml YPD培養(yǎng)液的250ml搖瓶中,控制起始OD600=~0.2,30℃、220r/min培養(yǎng),定期取樣測定OD600值,繪制生長曲線。
當(dāng)碳源為纖維二糖時(shí),試管種子液培養(yǎng)改為CMG-URA培養(yǎng)基,而搖瓶培養(yǎng)基改為YPC,定期取樣測定OD600值和β-葡萄糖苷酶及β-半乳糖苷酶酶活,其余類上。
1.6對(duì)酸醇的UPR信號(hào)響應(yīng)評(píng)價(jià)
將菌株W303-1A(leu 2∷UPRE-lacZ)和An-a(leu 2∷UPRE-lacZ)經(jīng)過兩次YPD液體培養(yǎng)基活化,接種于裝有105ml YPD培養(yǎng)基的500ml搖瓶中,控制初始OD600≥0.2,30℃、220r/min條件下培養(yǎng),當(dāng)OD600=2時(shí)停止培養(yǎng),分別分裝到5個(gè)100ml搖瓶中,每瓶菌液20ml,添加不同物質(zhì);考慮到乙醇容易揮發(fā),添加乙醇后的搖瓶,統(tǒng)一用美國Parafilm封口膜封上數(shù)層,于30℃、150r/min條件下限氧培養(yǎng);定期取樣測定OD600和β-半乳糖苷酶即Lac Z的比酶活值。
1.7β-半乳糖苷酶和β-葡萄糖苷酶酶活測定
β-半乳糖苷酶酶活測定:“技術(shù)和方案7酵母β-半乳糖苷酶的測定”方法進(jìn)行細(xì)胞裂解和粗提物制備、酶活測定;粗提物的蛋白質(zhì)含量測定使用北京天根公司Bradford蛋白質(zhì)定量試劑盒,操作按試劑盒說明書操作指南進(jìn)行。酶活單位U定義為:在測定條件下,1min內(nèi)水解產(chǎn)生1nmol ONP所需的酶量;粗酶液比酶活定義為:U/mg蛋白質(zhì)(nmol ONP/min/mg蛋白質(zhì))。
β-葡萄糖苷酶酶活測定:參見文獻(xiàn)。
需要說明的是:上述1.5到1.7的測定均至少設(shè)兩次重復(fù),結(jié)果里使用典型的、有代表性的數(shù)據(jù)。
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