研究簡介：本論文主要就結(jié)核分枝桿菌（Mycobacterium tuberculosis,Mtb）如何在宿主體內(nèi)適應(yīng)低氧環(huán)境，并利用這一適應(yīng)性來抑制宿主的免疫反應(yīng)進行了研究。研究表明Mtb是一種非常成功的細胞內(nèi)病原體，它在宿主巨噬細胞中生存，并在低氧的結(jié)核肉芽腫中形成。在這種低氧環(huán)境中，Mtb能夠通過改變其代謝途徑來抵抗宿主的免疫攻擊。研究團隊通過代謝組學、蛋白質(zhì)組學和遺傳學方法發(fā)現(xiàn)，在低氧條件下，Mtb能夠誘導其磷血清氨酸轉(zhuǎn)氨酶Rv0884c的表達，從而產(chǎn)生D-絲氨酸。這種D-絲氨酸的產(chǎn)生增加了Mtb在小鼠模型中的致病性，但它并不直接影響巨噬細胞內(nèi)Mtb的生存。相反D-絲氨酸通過抑制CD8+T細胞產(chǎn)生IFN-γ，間接降低了巨噬細胞限制Mtb的能力。這一發(fā)現(xiàn)揭示了Mtb如何利用代謝產(chǎn)物來干預(yù)宿主的免疫反應(yīng)。研究人員進一步探討了D-絲氨酸抑制IFN-γ產(chǎn)生的機制。發(fā)現(xiàn)D-絲氨酸與WDR24蛋白相互作用，抑制了mTORC1的激活，這導致了T-bet表達的降低和IFN-γ產(chǎn)生的減少。T-bet是一種轉(zhuǎn)錄因子，對于CD8+T細胞產(chǎn)生IFN-γ至關(guān)重要。這項研究不僅提供了Mtb如何在低氧環(huán)境中生存的新見解，而且還揭示了Mtb如何通過代謝途徑抑制宿主的適應(yīng)性免疫反應(yīng)。這些發(fā)現(xiàn)對于開發(fā)新的結(jié)核病治療策略具有潛在的重要價值。
Bioscreen全自動生長曲線分析儀的應(yīng)用
分枝桿菌在含有10%OADC、0.05%Tween-80和所需抗生素的7H9肉湯中生長至對數(shù)中期。使用Bioscreen C生長曲線儀器)和具有100個孔的蜂窩板測定每種菌株的生長曲線。簡而言之將200μl每種細菌懸浮液調(diào)整至相似密度，添加到每個孔中，并在37°C下振蕩培養(yǎng)H37Rv。每天測量OD 590。通過用50μl石蠟油覆蓋每個培養(yǎng)物來建立缺氧條件。H37Rv培養(yǎng)物在37°C下孵育14天。進行了三次獨立實驗，每個實驗一式三份。
實驗結(jié)果
Mtb在低氧環(huán)境下通過誘導Rv0884c（一種磷酸絲氨酸轉(zhuǎn)氨酶）的表達增加D-絲氨酸的產(chǎn)生，這一過程對于Mtb在宿主體內(nèi)的致病性至關(guān)重要。D-絲氨酸的產(chǎn)生并不直接影響Mtb在巨噬細胞內(nèi)的生存，而是通過抑制CD8+T細胞產(chǎn)生IFN-γ來間接影響巨噬細胞限制Mtb的能力。機制上，D-絲氨酸與WDR24蛋白相互作用，抑制了mTORC1的激活，導致T-bet表達下降和IFN-γ產(chǎn)生減少，從而抑制了CD8+T細胞的效應(yīng)功能。通過遺傳和藥理學方法抑制Rv0884c或D-絲氨酸的活性，可以增強CD8+T細胞的免疫反應(yīng)，減少Mtb在宿主體內(nèi)的存活和致病性。
圖1、a，通氣或缺氧條件下孵育14天的H37Rv差異分泌的部分代謝物的熱圖（左）和相對面積（右）。b，來自在通氣和缺氧下孵育指定天數(shù)的H37Rv培養(yǎng)物上清液的D-絲氨酸濃度的測定。c，通氣或缺氧14天的H37Rv細胞裂解物的蛋白質(zhì)組學分析中絲氨酸代謝相關(guān)蛋白的倍數(shù)變化。d，來自在通氣和缺氧下孵育的H37Rv的細胞裂解物的免疫印跡(IB)。使用ImageJ對Rv0884c和SigA蛋白的水平進行定量，并在印跡下方顯示。來自在通氣和缺氧下與或不與ATc一起孵育指定天數(shù)的Rv0884c_cKD Tet菌株的培養(yǎng)物上清液中的e，D-絲氨酸濃度。f、g、qPCR分析來自感染H37Rv(f)或Rv0884c_cKD Tet菌株的BMDM的Rv0884c mRNA，經(jīng)DMSO或ATc(g)處理并在正常空氣(-)或95%O 2(O 2)條件下孵育指定的時間。h、i、D-絲氨酸濃度，來自感染H37Rv或Rv0884c_cKD Tet菌株的iBMDM的培養(yǎng)物上清液(h)或細胞裂解物(i)，與或不與ATc一起孵育指定時間。nd，未檢測到。j–o，C57BL/6小鼠用GFP-H37Rv(j,k,m)、H37Rv(l)或Rv0884c_cKD Tet氣霧感染，然后用或不用多西環(huán)素(n,o)喂養(yǎng)4周。受感染的小鼠在處死前暴露于95%O 2或正?？諝庵?0小時。NC，未感染的小鼠。對PIMO（紅色）、H37Rv（綠色）、F4/80（粉色）和DAPI（藍色）進行肺免疫熒光染色。使用ImageJ(j)量化PIMO的平均熒光強度(MFI)。分析肺勻漿(k,o)和血清(l–n)上清液中的D-絲氨酸濃度。p、q、C57BL/6小鼠用指定的Mtb菌株氣溶膠感染4周。分析血清(p)和肺勻漿上清液(q)中的D-絲氨酸濃度。
圖2、a，Rv0884c_cKD Tet在有或沒有ATc的情況下在37℃通氣或缺氧條件下培養(yǎng)14天的體外生長曲線。b，添加10 mM D-絲氨酸的H37Rv在37℃通氣（左）或缺氧（右）條件下孵育14天的體外生長曲線。c–f，C57BL/6小鼠氣溶膠感染每只小鼠約200 cfu的Rv0884c_cKD Tet（含或不含ATc）、Rv0884c_cKD Tet（含ATc和D-絲氨酸）、Rv0884c_cKD Tet+Rv0884c(F108A)（含ATc）和Rv0884c_cKD Tet+Rv0 884c與ATc。感染4周后，通過H&E染色（c；比例尺，200μm（頂部）和100μm（底部））、組織學評分（d）、抗酸染色（e；比例尺，200μm（頂部）和100μm（底部））評估感染小鼠肺切片的組織病理學。比例尺，20μm（頂部）和10μm（底部））和細菌負載（f）。使用黃色虛線圓圈標記不同條件之間的白細胞浸潤區(qū)域。g–j，C57BL/6小鼠用每只小鼠約200 cfu的H37Rv氣霧感染，然后通過飲用水向一半受感染的小鼠施用30 g l-1 D-絲氨酸。感染4周后，通過H&E染色（g；比例尺，200μm（頂部）和100μm（底部））、組織學評分（h）、抗酸染色（i；比例尺）評估感染小鼠肺切片的組織病理學。比例尺，20μm（頂部）和10μm（底部））和細菌負載(j)。使用黃色虛線圓圈標記不同條件之間的白細胞浸潤區(qū)域。
圖3、a，使用cfu測定評估用或不用D-絲氨酸(10mM)處理的BMDM中的H37Rv(左)或用或不用ATc處理的BMDM中的Rv0884c_cKD Tet(右)的細胞內(nèi)存活。b，使用LIVE/DEAD BacLight細菌活力試劑盒測定BMDM中用或不用ATc處理的Rv0884c_cKD Tet的細菌活力。c，f，在IL-2和IL-12 p70存在下用抗CD3和抗CD28抗體激活和分化幼稚CD8+T細胞5天，并用PBS、D-絲氨酸或L-絲氨酸處理。測定了IFN-γ+(c)和CD69+(f)CD8+T細胞的百分比。APC，別藻藍蛋白。d、e、WT小鼠、Rag1?/?小鼠和Rag1?/?過繼轉(zhuǎn)移CD8+T細胞(Rag1?/?+CD8)的小鼠，用約200 cfu的指定Mtb菌株氣溶膠感染（d、Rv0884c_cKDTet和或無ATc、Rv0884c_cKDTet+Rv0884c(F108A)與ATc、以及Rv0884c_cKDTet+Rv0884c與ATc；e、H37Rv)或用D-絲氨酸處理。使用cfu測定確定感染后4周肺組織中的細菌負荷。g，將H37Rv感染的BMDM（MOI=5）和用或不用D-絲氨酸處理的活化的TB10Rg3 T細胞共培養(yǎng)2小時后，測量TB10Rg3 T細胞中CD69+TB10Rg3 T細胞的百分比。h，將H37Rv感染的BMDM（MOI=5）和用或不用D-絲氨酸處理的活化的TB10Rg3 T細胞共培養(yǎng)3天后，使用ELISA測量IFN-γ的表達。i，感染Mtb菌株1天后，將BMDM與用或不用D-絲氨酸處理的活化TB10Rg3 T細胞共孵育3天，并測定感染1或4天的BMDM中的細胞內(nèi)cfu。無T，未脈沖的BMDM組感染H37Rv 4天，未與T細胞共孵育；d1，感染H37Rv 1天且未與T細胞共孵育的未脈沖BMDM組；d4，感染H37Rv 4天的BMDM組；Rg3，用H37Rv感染4天并與TB10Rg3 T細胞共孵育的脈沖或非脈沖BMDM組。j、k、C57BL/6小鼠用每只小鼠約200 cfu的H37Rv氣霧感染，并給予D-絲氨酸4周。測量肺組織中IFN-γ+(j)和CD69+(k)CD8+T細胞的百分比；FMO用作對照
圖4、a)將特定Mtb菌株感染的骨髓來源的樹突狀細胞（BMDMs，MOI=5）與激活的TB10Rg3 T細胞共培養(yǎng)2小時后，測量TB10Rg3 T細胞中CD69陽性細胞的百分比。CD69是一種激活標志物，用于評估T細胞的激活狀態(tài)。b)將特定Mtb菌株感染的BMDMs與激活的TB10Rg3 T細胞共培養(yǎng)3天后，使用酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA）測量干擾素-γ（IFN-γ）的表達。IFN-γ是一種重要的細胞因子，通常在免疫反應(yīng)中由T細胞產(chǎn)生。c)在Mtb菌株感染1天后，將BMDMs與激活的TB10Rg3 T細胞共孵育3天，并確定感染1天或4天后BMDMs內(nèi)細胞內(nèi)的菌落形成單位（c.f.u.）。d-g)使用氣溶膠方式感染C57BL/6小鼠，每只小鼠約200個菌落形成單位的Rv0884c_cKDTet，有無ATc（四環(huán)素誘導劑）,Rv0884c_cKDTet與ATc和D-絲氨酸（30g/L）,v0884c_cKDTet+Rv0884c(F108A)與ATc，以及Rv0884c_cKDTet+Rv0884c與ATc。感染4周后，檢測以下指標：CD69+CD8+T細胞的百分比（d）；肺組織中CD8+IFN-γ+T細胞的百分比（e），或從引流淋巴結(jié)（dLNs）中（f）；以及肺組織中CD44high CD8+T細胞的CD69平均熒光強度（MFI）（g）。h)將肽（TB10.44–11）脈沖處理的BMDMs感染Rv0884c_cKDTet，有無ATc處理1天，然后與體外分化的CD8+T細胞共培養(yǎng)3天，這些T細胞來自C57BL6小鼠或CD4CreIfngfl/fl小鼠的脾臟。感染4天后測量細菌負荷。i-k)CD4CreIfngfl/fl小鼠通過氣溶膠方式感染Rv0884c_cKDTet，有無ATc，每只小鼠約200個菌落形成單位，持續(xù)4周。通過蘇木精-伊紅（H&E）染色（i，頂部；比例尺，100μm）、抗酸染色（i，底部；比例尺，20μm）評估感染小鼠肺組織的組織病理學，以及組織學評分（j）和細菌負荷（k）。
圖5、a，進行Co-IP以檢測T細胞中D-絲氨酸和WDR24之間的相互作用。印跡下方的值表示使用ImageJ進行的光密度定量。b，使用體外GST Pull-down測定檢測D-絲氨酸與WDR24的直接相互作用。印跡下方的值表示使用ImageJ進行的光密度定量。c，進行Co-IP以檢測WDR24與GATOR2（SEC13）的其他成分的相互作用，該相互作用被D-絲氨酸中斷。印跡下方的值表示使用ImageJ進行的光密度定量。d–f，WDR24敲低CD8+T細胞用PBS或D-絲氨酸處理。使用FACS分析WT CD8+T細胞或WDR24敲低CD8+T細胞中S6(d)的磷酸化、T-bet(e)和IFN-γ(f)的表達。g，i，感染H37Rv（MOI=5）1天的BMDM與TB10Rg3 T細胞或用或不用D-絲氨酸（10 mM）處理的WDR24敲低TB10Rg3 T細胞共同孵育另外3天。ELISA法檢測IFN-γ的表達（g）；確定了BMDM中的細胞內(nèi)CFU(i)。h,j,BMDMs用指定的Mtb菌株(MOI=5)感染1天，并與TB10Rg3 T細胞或WDR24敲低TB10Rg3 T細胞共孵育3天。采用ELISA法檢測IFN-γ的表達（h）；測定了BMDM中的細胞內(nèi)CFU(j)。k，CD4 Cre WDR24 fl/fl小鼠用每只小鼠約200 cfu的Rv0884c_cKD Tet氣霧感染，用或不用ATc治療4周。使用cfu測定法測定肺組織中的細菌負荷。
總結(jié)
適應(yīng)缺氧是結(jié)核分枝桿菌（Mtb）在體內(nèi)生存的主要挑戰(zhàn)。產(chǎn)生干擾素(IFN)-γ的CD8+T細胞有助于控制結(jié)核分枝桿菌感染，部分是通過促進巨噬細胞的抗菌活性。結(jié)核分枝桿菌是否會對抗這些反應(yīng)，特別是在缺氧條件下，目前仍不清楚。利用代謝組學、蛋白質(zhì)組學和遺傳學方法，研究人員證明Mtb誘導Rv0884c(SerC)（一種Mtb磷酸絲氨酸轉(zhuǎn)氨酶）產(chǎn)生D-絲氨酸。這種活性增加了小鼠中Mtb的發(fā)病機制，但并不直接影響巨噬細胞內(nèi)Mtb的存活。相反D-絲氨酸抑制CD8+T細胞產(chǎn)生IFN-γ，從而間接降低了巨噬細胞在共培養(yǎng)時限制Mtb的能力。從機制上講，D-絲氨酸與WDR24相互作用并抑制CD8+T細胞中mTORC1的激活。這降低了CD8+T細胞的T-bet表達并減少了IFN-γ的產(chǎn)生。研究結(jié)果表明結(jié)核分枝桿菌逃避機制，其中病原體對缺氧的代謝適應(yīng)導致適應(yīng)性抗結(jié)核免疫的氨基酸依賴性抑制。本研究提供了提供了Mtb如何在低氧環(huán)境中生存的新見解，而且還揭示了Mtb如何通過代謝途徑抑制宿主的適應(yīng)性免疫反應(yīng)。這些發(fā)現(xiàn)對于開發(fā)新的結(jié)核病治療策略具有潛在的重要價值。
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