2.4不同溫度固態(tài)發(fā)酵高粱揮發(fā)性化合物差異分析
為找出不同發(fā)酵溫度條件下發(fā)酵高粱的特征差異化合物，運用偏最小二乘判別分析(partial least squares discrimination analysis,PLS-DA)對比了45℃和50℃條件下發(fā)酵高粱的揮發(fā)性化合物結(jié)構(gòu)。結(jié)果顯示，2種溫度條件下?lián)]發(fā)性化合物結(jié)構(gòu)差異顯著(P<0.01)(圖8A)。經(jīng)過200次置換驗證，R2大于Q2且Q2的起點為負數(shù)，該參數(shù)證明PLS-DA模型是可靠的(圖8B)。根據(jù)變異權(quán)重參數(shù)值(variable importance in projection,VIP)大于1篩選特征差異化合物，共篩選到27種，使用Z-score標準化每種揮發(fā)性化合物并繪制聚類熱圖(圖8C)。45℃條件下癸酸乙酯、苯乙酸乙酯和棕櫚酸乙酯等酯類物質(zhì)含量更高，在45℃條件下含量隨著發(fā)酵天數(shù)的增加而升高，而50℃則呈現(xiàn)相反趨勢，推測45℃條件下利于酯類物質(zhì)的合成。50℃條件下酮類和酸類物質(zhì)含量更高，如5-甲基-2-己酮、4,6-二甲基-2庚酮、環(huán)己酮、異丁酸、己酸等，推測50℃條件下更利于象牙色克羅彭斯特德菌代謝產(chǎn)生酮類和酸類物質(zhì)。
圖8不同溫度發(fā)酵高粱風(fēng)味物質(zhì)差異分析
A：PLS-DA模型.B：200次置換檢驗.C：特征差異物質(zhì)聚類熱圖
2.5不同發(fā)酵天數(shù)固態(tài)發(fā)酵揮發(fā)性化合物差異分析
為找出不同發(fā)酵天數(shù)存在的特征差異化合物，分別對菌株K.eburnea 1613、K.eburnea 1615、K.eburnea 6E22發(fā)酵高粱揮發(fā)性物質(zhì)進行不同發(fā)酵天數(shù)的差異分析，PLS-DA顯示揮發(fā)性化合物組成特點差異顯著(P<0.05)(圖9A)。經(jīng)過200次置換驗證，R2大于Q2且Q2的起點為負數(shù)，該參數(shù)證明PLS-DA模型是可靠的(圖9B)。使用VIP值大于1篩選出26種特征差異物質(zhì)，使用Z-score標準化每種揮發(fā)性化合物并繪制聚類熱圖(圖9C)。1-烯-3-辛醇、2,3-二氫苯并呋喃和糠醛等在發(fā)酵第0天含量最高，糠醛被認為與醬香型白酒基酒焦糊味正相關(guān)。苯甲醛、α-松油醇和2-甲基吡嗪類物質(zhì)在發(fā)酵第4天或第7天含量最高。α-松油醇是萜烯類化合物，具有松木香，是醬香型白酒中重要的香氣成分，可以讓酒體更加優(yōu)雅細膩。萜烯類、吡嗪類化合物可能在發(fā)酵過程中作為前體物質(zhì)被轉(zhuǎn)化為其他物質(zhì)，有研究通過全基因組數(shù)據(jù)挖掘發(fā)現(xiàn)放線菌糖萊斯氏菌(Laceyella sacchari)具有四甲基吡嗪生物合成的完整途徑。苯乙醇、異戊酸、異丁酸、乙酸苯乙酯和棕櫚酸甲酯等在發(fā)酵第15天時含量最高。乙酸苯乙酯和棕櫚酸甲酯貢獻了酒體中的花香、果香風(fēng)味，屬于高沸點物質(zhì)，能夠延長酒體后味。結(jié)果表明，象牙色克羅彭斯特德菌在堆積發(fā)酵的不同時間階段能積累不同的風(fēng)味化合物，可為生產(chǎn)中通過控制堆積發(fā)酵時間調(diào)控象牙色克羅彭斯特德菌的生長代謝提供理論參考。
圖9不同發(fā)酵天數(shù)高粱風(fēng)味物質(zhì)差異分析
A：PLS-DA模型.B：200次置換檢驗.C：特征差異物質(zhì)聚類熱圖
3、結(jié)論
高溫堆積發(fā)酵是醬香型白酒生產(chǎn)中必不可少的關(guān)鍵工藝環(huán)節(jié)，直接影響醬香型白酒的質(zhì)量和產(chǎn)量。本研究針對堆積發(fā)酵過程酒醅中的優(yōu)勢細菌屬克羅彭斯特德菌屬(Kroppenstedtia)進行分離篩選和代謝特征分析。經(jīng)過形態(tài)特征及16S rRNA基因測序分析，共分離獲得3株象牙色克羅彭斯特德菌(K.eburnea)。在TSB液體培養(yǎng)基45℃純培養(yǎng)條件下，3株菌在18 h進入對數(shù)生長期，32 h進入平穩(wěn)期，36 h時從菌液中檢出的揮發(fā)性化合物主要是吡嗪類，其中菌株K.eburnea 1613的2,5-二甲基吡嗪含量最高，為5.26 mg/L，K.eburnea 1613的揮發(fā)性化合物含量普遍高于其余2株菌。
參考醬香型白酒堆積發(fā)酵條件，進行了恒溫(45℃和50℃)固態(tài)發(fā)酵高粱實驗，以研究它們在堆積酒醅中的生長和代謝特點。3株菌發(fā)酵高粱中檢出的揮發(fā)性化合物總量隨發(fā)酵時間呈明顯的上升趨勢，主要為醇類和酸類，占比之和為30.72%?84.01%，50℃發(fā)酵高粱中檢出的醇類、酸類和吡嗪類物質(zhì)含量均高于45℃的，而酯類物質(zhì)低于45℃的。與對照相比，3株菌均促進了含量最高的醇類物質(zhì)苯乙醇和吡嗪類物質(zhì)的2,5-二甲基吡嗪產(chǎn)生，產(chǎn)量優(yōu)勢菌株分別是K.eburnea 1615和K.eburnea 6E22；K.eburnea 1613和K.eburnea 1615在酸類物質(zhì)積累上表現(xiàn)出明顯優(yōu)勢，主要為異戊酸，其次是己酸。
對照組中主要的醛類物質(zhì)含量高于3個實驗組，固態(tài)發(fā)酵過程中醛類總量較穩(wěn)定，酮類在15 d時最高，值得注意的是，高溫有助于對照組中醛類和酮類物質(zhì)的積累。菌株K.eburnea 1615在45℃發(fā)酵15 d時酮類總量最高，是對照的2.09倍。PLS-DA分析進一步顯示不同發(fā)酵溫度和時間下菌株固態(tài)發(fā)酵高粱中揮發(fā)性化合物結(jié)構(gòu)差異顯著。
本研究從菌株水平上探討了象牙色克羅彭斯特德菌的風(fēng)味物質(zhì)代謝特征，并分析了溫度對發(fā)酵高粱中揮發(fā)性化合物積累的影響，為認識高溫堆積過程耐高溫微生物在醬香型白酒風(fēng)味形成中的作用提供理論基礎(chǔ)。
醬香型白酒堆積酒醅中分離克羅彭斯特德菌生長和揮發(fā)性化合物代謝特征（一）
醬香型白酒堆積酒醅中分離克羅彭斯特德菌生長和揮發(fā)性化合物代謝特征（二）
醬香型白酒堆積酒醅中分離克羅彭斯特德菌生長和揮發(fā)性化合物代謝特征（三）
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