2、結(jié)果與討論
2.1基因敲除重組菌的構(gòu)建結(jié)果
圖2為基因sfcA、fumB、fumC和maeB敲除驗(yàn)證結(jié)果。擴(kuò)增sfcA基因時(shí)，先后使用2對(duì)不同的上下游引物進(jìn)行PCR，但未得到任何擴(kuò)增產(chǎn)物，推測sfcA基因已被敲除，再設(shè)計(jì)引物sfcA1和sfcA2，將目的基因包括其上下游各300 bp左右一起擴(kuò)增，但PCR結(jié)果只有約200 bp，之后以野生菌E.coli B0013染色體為模板，PCR結(jié)果與預(yù)期(2379 bp)相符合，驗(yàn)證結(jié)果見圖2(a)。由圖2(a)可知:sfcA基因已被敲除，原因可能是在前期菌株改造過程中，某個(gè)突變盒的同源臂與該基因有較高同源性，導(dǎo)致基因同時(shí)被敲除。
圖2基因敲除驗(yàn)證
基因fumB、fumC和maeB的敲除驗(yàn)證見圖2(c)～圖2(d)，使用相同引物對(duì)出發(fā)菌株和基因敲除菌株進(jìn)行PCR，擴(kuò)增產(chǎn)物的大小有明顯差異，證明目標(biāo)基因片段已從染色體上刪除。對(duì)3株基因敲除重組菌分別命名為E.coli 2010、E.coli 2020和E.coli 2030。對(duì)于fumA基因，考慮到其主要在有氧條件下作用［13］，為保證菌體在有氧條件下的正常生長，本研究未對(duì)其進(jìn)行敲除。
2.2重組菌的生理特性與發(fā)酵實(shí)驗(yàn)結(jié)果
利用Red同源重組系統(tǒng)結(jié)合Xer/dif重組酶系統(tǒng)，成功構(gòu)建1株富馬酸酶基因(fumB和fumC)和蘋果酸酶基因(sfcA和maeB)重疊缺失突變株E.coli 2030，將該重組菌分別于LB和M9培養(yǎng)基中培養(yǎng)，測定600 nm處吸光值A(chǔ)600，以E.coli B0013-1050為對(duì)照菌株，繪制生長曲線，結(jié)果見圖3。由圖3可知:所構(gòu)建的重組菌的生長狀況對(duì)比于出發(fā)菌株沒有太大差別，表明敲除fumB、fumC和maeB基因并不會(huì)對(duì)菌體的好氧生長產(chǎn)生影響。
圖3 E.coli B0013-1050及其突變株E.coli 2030的生長特性比較
對(duì)重組菌E.coli 2010、2020和2030進(jìn)行搖瓶發(fā)酵試驗(yàn)，以出發(fā)菌E.coli B0013-1050作為對(duì)照，發(fā)酵結(jié)果見表2。由表2可知:敲除基因fumB的重組菌E.coli 2010厭氧發(fā)酵的主要產(chǎn)物是丙酮酸和琥珀酸，和出發(fā)菌相比較，琥珀酸的產(chǎn)量下降，葡萄糖-琥珀酸轉(zhuǎn)化率由出發(fā)菌的38.9%下降為26%。而繼續(xù)敲除fumC基因的重組菌E.coli 2020的琥珀酸產(chǎn)量卻只有微弱的下降，并未到達(dá)預(yù)期中完全消除琥珀酸積累的目的。
表2基因敲除重組菌搖瓶發(fā)酵結(jié)果
與之前2株重組菌相比，繼續(xù)敲除蘋果酸酶基因的重組菌E.coli 2030發(fā)酵產(chǎn)物中，琥珀酸的轉(zhuǎn)化率變化不大，而丙酮酸的轉(zhuǎn)化率下降，最終生成蘋果酸1.76 g/L，葡萄糖-蘋果酸轉(zhuǎn)化率為17.6%。
重組菌2030在15 L罐中發(fā)酵，考察其產(chǎn)酸能力，發(fā)酵結(jié)果如圖4所示。由圖4可知:厭氧發(fā)酵30 h，耗糖24 g/L，最終產(chǎn)L-蘋果酸12.5 g/L，葡萄糖-蘋果酸轉(zhuǎn)化率為52.1%，生產(chǎn)強(qiáng)度0.42 g/(L·h)。丙酮酸轉(zhuǎn)化率下降到19.3%。發(fā)酵液中還檢測到琥珀酸和少量的乳酸。
圖4重組大腸桿菌E.coli 2030在15 L發(fā)酵罐中發(fā)酵產(chǎn)酸情況
2.3蘋果酸脫氫酶基因mdh表達(dá)量對(duì)L-蘋果酸產(chǎn)率的影響
蘋果酸脫氫酶(malate dehydrogenase，MDH，EC 1.1.1.37)是筆者所構(gòu)建的L-蘋果酸合成途徑中的一個(gè)關(guān)鍵酶，通過強(qiáng)化MDH的表達(dá)，可引導(dǎo)代謝流更多地走向L-蘋果酸合成途徑，提高目的產(chǎn)物的轉(zhuǎn)化率。Peleg等［14］發(fā)現(xiàn)在黃曲霉中L-蘋果酸的合成主要來自于草酰乙酸，蘋果酸脫氫酶在L-蘋果酸生產(chǎn)中起到了重要作用。本文此前構(gòu)建的合成途徑也是由草酰乙酸生成L-蘋果酸，因此克隆了來源于黃曲霉的蘋果酸脫氫酶基因mdh，連接至不同拷貝數(shù)載體，并在重組菌E.coli 2030中進(jìn)行表達(dá)，考察其表達(dá)量對(duì)L-蘋果酸產(chǎn)率的影響。
繪制含不同拷貝數(shù)質(zhì)粒的重組菌在M9培養(yǎng)基中的生長曲線，結(jié)果見圖5。由圖5可知:在相同的培養(yǎng)條件下，攜帶高拷貝質(zhì)粒的重組菌所能達(dá)到的菌體濃度明顯小于攜帶中低拷貝數(shù)質(zhì)粒的重組菌，這是因?yàn)楦嗟哪芰勘挥糜诘鞍踪|(zhì)合成而影響了菌體的生長。其余2個(gè)重組菌的生長狀況相似，對(duì)比于重組菌E.coli 2030，最終的菌體濃度也沒有太大差別。這表明蘋果酸脫氫酶的表達(dá)量應(yīng)控制在中低水平，過高則會(huì)影響菌體的生長。
以菌株E.coli 2030作為對(duì)照，對(duì)含不同拷貝數(shù)質(zhì)粒的重組菌進(jìn)行搖瓶發(fā)酵試驗(yàn)，發(fā)酵結(jié)果見表3。由表3可知:厭氧發(fā)酵36 h后，相較于對(duì)照菌，L-蘋果酸的產(chǎn)量和轉(zhuǎn)化率都有不同程度的提高，并且隨著拷貝數(shù)的降低，L-蘋果酸的轉(zhuǎn)化率也逐漸升高。上述結(jié)果表明，想要獲得較好的強(qiáng)化作用，需要將蘋果酸脫氫酶的表達(dá)量控制在較低的水平，而不是越高越好。
圖5攜帶不同拷貝數(shù)質(zhì)粒的重組菌生長曲線
表3含有不同拷貝數(shù)質(zhì)粒的重組菌產(chǎn)L-蘋果酸能力的比較
2.4重組菌E.coli 2040的構(gòu)建及其發(fā)酵實(shí)驗(yàn)結(jié)果
為了實(shí)現(xiàn)蘋果酸脫氫酶基因的穩(wěn)定遺傳并控制其表達(dá)量在較低水平，將mdh基因整合表達(dá)于重組菌中。根據(jù)之前的基因敲除方法，將同源重組突變盒maeB'::difGm連接至pMD18-T-maeB'::pNmdh，構(gòu)建突變盒maeB'::difGm-pNmdh，使用該突變盒在敲除maeB基因的同時(shí)，將基因mdh整合于重組大腸桿菌染色體上。基因整合的驗(yàn)證結(jié)果見圖6。由圖6可知，mdh已整合于重組菌染色體上，將該菌命名為E.coli 2040。
圖7為E.coli 2040在15 L罐中厭氧發(fā)酵結(jié)果。由圖7可知:厭氧發(fā)酵30 h，耗糖23.2 g/L，最終產(chǎn)L-蘋果酸14 g/L，葡萄糖-蘋果酸轉(zhuǎn)化率為60.3%，生產(chǎn)強(qiáng)度0.47 g/(L·h)。
對(duì)于利用大腸桿菌直接發(fā)酵生產(chǎn)L-蘋果酸，國內(nèi)外學(xué)者已有一定的研究，Zhang等［15］以產(chǎn)琥珀酸重組大腸桿菌KJ073為出發(fā)菌，繼續(xù)敲除富馬酸酶fumAC和fumB，延胡索酸還原酶frdBC，蘋果酸酶sfcA和maeB，得到菌株XZ658，在3 L罐中，經(jīng)兩段式發(fā)酵72 h，耗糖32.8 g/L，最終產(chǎn)蘋果酸34 g/L，葡萄糖-蘋果酸轉(zhuǎn)化率為103.8%，生產(chǎn)強(qiáng)度0.47 g/(L·h)，其他的雜酸只有少量的琥珀酸、乳酸和乙酸(1 g/L左右)，是目前產(chǎn)L-蘋果酸大腸桿菌中轉(zhuǎn)化率最高的1株。但由于fumA基因的缺失，重組菌的生長受到影響，導(dǎo)致發(fā)酵周期的延長(有氧培養(yǎng)16 h，發(fā)酵周期72 h)。本文菌株擁有較好的生長性能，可為后期的厭氧轉(zhuǎn)化提供較高的初始菌體濃度，并縮短整個(gè)發(fā)酵周期，在此基礎(chǔ)上繼續(xù)對(duì)菌株進(jìn)行改造，提高蘋果酸的產(chǎn)量及轉(zhuǎn)化率，則可獲得性能更為優(yōu)良的菌株。
圖6 mdh基因整合表達(dá)的驗(yàn)證
圖7重組大腸桿菌E.coli 2040在15 L發(fā)酵罐中發(fā)酵產(chǎn)酸情況
3、結(jié)論
基于重組大腸桿菌E.coli B0013-1050的琥珀酸生成途徑，利用Red同源重組結(jié)合Xer/dif重組系統(tǒng)敲除富馬酸酶基因fumB和fumC，蘋果酸酶基因sfcA和maeB，成功構(gòu)建L-蘋果酸合成途徑，經(jīng)15 L罐發(fā)酵產(chǎn)L-蘋果酸12.5 g/L，葡萄糖-蘋果酸轉(zhuǎn)化率為52.1%，主要雜酸為丙酮酸及琥珀酸;之后引入來源于黃曲霉的蘋果酸脫氫酶，強(qiáng)化該途徑，使L-蘋果酸產(chǎn)量提高到14 g/L，葡萄糖-蘋果酸轉(zhuǎn)化率提高到60.3%，同時(shí)降低了丙酮酸及琥珀酸的轉(zhuǎn)化率。
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