2、結(jié)果
2．1菌液的特異性與純度檢驗(yàn)結(jié)果
經(jīng)純檢，48 h后普通營養(yǎng)瓊脂平板表面無細(xì)菌長出，表明細(xì)菌培養(yǎng)過程中無污染；菌落PCR檢測(cè)在500 bp處出現(xiàn)了清晰的電泳條帶（圖1），表明本試驗(yàn)培養(yǎng)的3個(gè)菌株皆為副雞禽桿菌。
圖1副雞禽桿菌A、B、C 3個(gè)血清型參考菌株的PCR檢測(cè)結(jié)果
2．2分光光度法和菌落計(jì)數(shù)法繪制副雞禽桿菌A、B、C 3個(gè)血清型參考菌株的生長曲線
采用菌液OD 600 nm值和活菌計(jì)數(shù)值（cfu／m L）的對(duì)數(shù)為縱坐標(biāo)分別繪制3個(gè)血清型參考菌株的生長曲線（圖2，圖3）。圖2是以菌液OD 600 nm值為縱坐標(biāo)繪制的生長曲線，3個(gè)血清型參考菌株生長規(guī)律基本一致，即在監(jiān)測(cè)之初5 h即進(jìn)入了對(duì)數(shù)生長期，13 h達(dá)到穩(wěn)定期，持續(xù)到14 h后OD 600 nm值開始急劇下降進(jìn)入衰退期，15 h以后OD 600 nm值開始下降得比較緩慢。如圖2所示，3個(gè)血清型菌株的生長穩(wěn)定期都很短。
圖3是以活菌計(jì)數(shù)值（cfu／m L）的對(duì)數(shù)為縱坐標(biāo)繪制的生長曲線，3個(gè)血清型參考菌株在監(jiān)測(cè)之初5 h即進(jìn)入了對(duì)數(shù)生長期，C型菌株達(dá)到生長高峰的時(shí)間最短，為10 h，但是C型達(dá)到生長高峰時(shí)的活菌數(shù)卻最少，為15億；其次是A型，培養(yǎng)11 h達(dá)到活菌數(shù)高峰，為31．6億；B型培養(yǎng)至12 h達(dá)到活菌數(shù)高峰，為43億。3個(gè)血清型菌株達(dá)到生長高峰后的1 h內(nèi)，A型和C型活菌數(shù)衰減大約2／3，B型活菌數(shù)衰減了14倍。因?yàn)樵诰晟L高峰時(shí)段采用了1 h的監(jiān)測(cè)頻率，因此，3個(gè)血清型菌株的生長穩(wěn)定期都短于1 h。
圖2副雞禽桿菌A、B、C 3個(gè)血清型參考菌株的生長曲線（分光光度法）
圖3副雞禽桿菌A、B、C 3個(gè)血清型參考菌株的生長曲線（活菌計(jì)數(shù)法）
2．3 3個(gè)血清型參考菌株在對(duì)數(shù)生長期和穩(wěn)定期OD 600 nm值和活菌數(shù)之間的函數(shù)關(guān)系
由圖2和圖3可看出，分光光度法和菌落計(jì)數(shù)法的生長曲線差異較大，當(dāng)菌液OD 600 nm值達(dá)到最高值時(shí)活菌數(shù)已不是最多，二者之間不呈線性相關(guān)。取3個(gè)血清型菌株對(duì)數(shù)生長期至穩(wěn)定期的數(shù)據(jù)，以O(shè)D 600 nm值為橫坐標(biāo)，菌液中活菌數(shù)對(duì)數(shù)為縱坐標(biāo)，繪制兩者的回歸曲線，結(jié)果為一元二次多項(xiàng)式回歸，見圖4、圖5和圖6。3個(gè)血清型參考菌株的回歸方程分別為y＝－25．60x2＋34．75x－1．789，相關(guān)指數(shù)R2＝0．913（A型）；y＝－42．90x2＋50．04x－4．513，相關(guān)指數(shù)R2＝0．995（B型）；y＝－23．03x2＋30．31x－0．715，相關(guān)指數(shù)R2＝0．936（C型）。3個(gè)血清型回歸方程的擬合度都比較高，其中，以B型回歸方程估測(cè)的可靠程度最高，其次是C型和A型。
圖4 A型參考菌株OD 600 nm值與活菌數(shù)對(duì)數(shù)之間的函數(shù)關(guān)系圖
圖5 B型參考菌株OD 600 nm值與活菌數(shù)對(duì)數(shù)之間的函數(shù)關(guān)系圖
圖6 C型參考菌株OD 600 nm值與活菌數(shù)對(duì)數(shù)之間的函數(shù)關(guān)系圖
3、討論
細(xì)菌的生長曲線反映了細(xì)菌在培養(yǎng)過程中生長、繁殖和衰亡的規(guī)律，在適宜條件下培養(yǎng)，會(huì)出現(xiàn)延滯期、對(duì)數(shù)生長期、穩(wěn)定期和衰退期4個(gè)階段。在研究細(xì)菌的各種特性時(shí)，生長曲線有助于選擇到生長狀態(tài)比較一致的細(xì)菌，一般選擇剛開始進(jìn)入平臺(tái)期的細(xì)菌。因此，在進(jìn)行細(xì)菌生物特性比較研究之前，找到細(xì)菌的穩(wěn)定期，對(duì)于試驗(yàn)結(jié)果的可靠性有著重要的意義。
本試驗(yàn)比較了3個(gè)不同血清型副雞禽桿菌參考菌株在體外培養(yǎng)條件下的生長曲線，采用分光光度法和活菌計(jì)數(shù)法兩種方法，兩種方法獲得的生長曲線差異較大，不能用菌液OD 600 nm值來直接衡量活菌數(shù)的多少。在對(duì)數(shù)生長期和穩(wěn)定期，菌液OD 600 nm值和活菌數(shù)之間不呈現(xiàn)線性關(guān)系，而是呈現(xiàn)比較復(fù)雜的一元二次多項(xiàng)式回歸關(guān)系，這一特性與其他菌的相關(guān)報(bào)道不一致［4－6］。這與菌種本身的特性有關(guān)，因?yàn)楦彪u禽桿菌是一種非常敏感的細(xì)菌，對(duì)外界溫度及理化因素的抵抗力均較弱，在固體培養(yǎng)基上的菌落，4℃下存放超過5 d～7 d，就不再有存活的細(xì)菌。在適宜液體培養(yǎng)基中，常溫下衰亡的速度也很快，反復(fù)凍融會(huì)大大降低菌液中的活菌數(shù)。
另外，副雞禽桿菌在體外培養(yǎng)的生長要求苛刻，大多數(shù)菌株需要還原型輔酶A，即使如此，本菌的生長和繁殖能力也無法和其他禽類的致病菌相比，3個(gè)血清型菌株達(dá)到生長高峰時(shí)的活菌數(shù)只能與靜置培養(yǎng)的大腸埃希菌［8］、鴨疫里默菌活菌數(shù)相當(dāng)，只有搖振培養(yǎng)的鴨疫里默菌活菌數(shù)的1／10［9］。而且，該菌的生長穩(wěn)定期非常短暫，因此，在培養(yǎng)副雞禽桿菌進(jìn)行滅活疫苗生產(chǎn)時(shí)，一定要把握好收獲菌液的時(shí)間。
本試驗(yàn)結(jié)果不但為進(jìn)一步菌株生物學(xué)特性比較奠定了基礎(chǔ)，而且為今后的副雞禽桿菌毒力比較試驗(yàn)及疫苗的研制奠定了基礎(chǔ)。
副雞禽桿菌生長曲線測(cè)定方法：分光光度法VS菌落計(jì)數(shù)法（一）
副雞禽桿菌生長曲線測(cè)定方法：分光光度法VS菌落計(jì)數(shù)法（二）
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