摘要：為探索副雞禽桿菌生長特性，比較不同血清型菌株生長特性的差異，采用分光光度法和菌落計(jì)數(shù)法分別測定副雞禽桿菌血清A型（221株）、血清B型（0222株）、血清C型（Modesto株）3個(gè)參考菌株的生長曲線，對兩種方法測定的生長曲線進(jìn)行比較。結(jié)果表明，兩種方法繪制的生長曲線差異較大，對數(shù)生長期和穩(wěn)定期菌液OD 600 nm值與活菌數(shù)對數(shù)之間呈現(xiàn)一元二次多項(xiàng)式回歸關(guān)系。另外，3個(gè)血清型菌株的生長穩(wěn)定期都比較短暫，各型菌株達(dá)到生長高峰的時(shí)間和活菌數(shù)都有差異。該試驗(yàn)為副雞禽桿菌生物學(xué)特性的比較研究及疫苗的研制奠定了基礎(chǔ)。
副雞禽桿菌（Avibacteriumparagallinarum）原稱副雞嗜血桿菌（Haemophilusparagallinarum），是一種無芽胞的革蘭陰性桿菌，兼性厭氧，于固體培養(yǎng)基接種培養(yǎng)時(shí)需要5%～10%的CO2環(huán)境，最適生長溫度為37℃，單個(gè)菌落在45°光照下呈藍(lán)色透明狀，但隨著體外傳代次數(shù)的增加，菌落色澤將減弱或消失。該菌在體外培養(yǎng)的生長要求苛刻，需要NAD（輔酶Ⅰ）的參與，但不是所有菌型都需要，南非和墨西哥對NAD非依賴性菌株已有報(bào)道［1－2］。
該菌是雞傳染性鼻炎的病原菌，主要引起雞的上呼吸道疾病，表現(xiàn)為雞的生長停滯和蛋雞產(chǎn)蛋率下降，且呈世界性分布，可導(dǎo)致嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。最常用的Page分型法將副雞禽桿菌分為A、B、C 3個(gè)血清型，Kume法將Av．paragallinarum分為3個(gè)血清群Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ群，其Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ群分別相當(dāng)于Page A型、C型和B型。我國分離株多為A型和B型，C型只有一例報(bào)道［3］。該病發(fā)生后的治愈率高，但易復(fù)發(fā)，目前主要采取多價(jià)滅活疫苗來控制其發(fā)生和傳播。
細(xì)菌生長曲線的繪制方法主要有分光光度法和菌落計(jì)數(shù)法兩種。分光光度法是通過測定菌液的OD 600 nm值，得出的是菌液中包含的總菌數(shù)，該方法的優(yōu)點(diǎn)是操作簡便。菌落計(jì)數(shù)法得出的是菌液中的活菌數(shù)，相對來說要準(zhǔn)確得多，但是操作復(fù)雜而且耗時(shí)、耗力。對于一些細(xì)菌兩種方法繪制的生長曲線有很好的相關(guān)性［4－6］。本研究的目的是在同樣的條件下培養(yǎng)3個(gè)不同血清型副雞禽桿菌參考菌株，采用分光光度法和活菌計(jì)數(shù)法測定菌株的生長曲線，了解其生長特性并比較菌株之間的差異，另外，通過試驗(yàn)評價(jià)是否可以用分光光度法的OD 600 nm值來衡量菌液中的活菌數(shù)量，為副雞禽桿菌的生物特性比較研究和疫苗生產(chǎn)提供參考依據(jù)。
1材料與方法
1．1材料
1．1．1菌株副雞禽桿菌A、B、C 3個(gè)血清型參考菌株，A型（221株）、B（0222株）和C（Modesto株）由澳大利亞昆士蘭州動(dòng)物研究所Blackall博士惠贈(zèng)。
1．1．2培養(yǎng)基TSA固體培養(yǎng)基（含0．025 g／L NAD和100 m L／L雞血清）；TSB液體培養(yǎng)基（含0．025 g／L NAD和100 m L／L雞血清）。
1．2方法
1．2．1合成引物和PCR擴(kuò)增根據(jù)文獻(xiàn)［7］合成擴(kuò)增副雞禽桿菌500 bp基因片段的引物序列，對培養(yǎng)的細(xì)菌進(jìn)行PCR檢測，判斷培養(yǎng)物是否為副雞禽桿菌。上游引物為：5′－TGA GGG TAG TCT TGC ACG CGA AT－3′，下游引物為：5′－CAA GGT ATC GAT CGT CTC TCT ACT－3′。反應(yīng)體系為：2×buffer 12．5μL，Taq（5 U／μL）0．5μL，d NTP（2．5 mmol／L）2μL，N1（10μmol／L）1μL，R1（10μmol／L）1μL，樣品4μL，滅菌去離子水4μL，總體積為25μL。PCR反應(yīng)條件為：94℃5 min；94℃45 s，56℃45 s，72℃1 min，進(jìn)行30個(gè)循環(huán)；72℃10 min，4℃結(jié)束反應(yīng)。
1．2．2細(xì)菌培養(yǎng)將800 m L／L甘油保存的菌種復(fù)蘇，無菌接種于TSA培養(yǎng)基，于37℃、5%的CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h～30 h。經(jīng)PCR驗(yàn)證后挑取單個(gè)菌落轉(zhuǎn)接至5 m L TSB液體培養(yǎng)基，于37℃搖振培養(yǎng)12 h，再按1∶60體積比例轉(zhuǎn)接至100 m L TSB中擴(kuò)大培養(yǎng)，于180 r／min 37℃搖振培養(yǎng)24 h。
1．2．3菌液OD 600 nm值測定和活菌計(jì)數(shù)每隔1 h～2 h在無菌條件下收獲少量菌液，用于測量OD 600 nm值，并用滅菌生理鹽水進(jìn)行梯度稀釋后各取3個(gè)稀釋度的菌液50μL涂布TSA平板，于37℃、5%的CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)至48 h，然后進(jìn)行菌落計(jì)數(shù)，根據(jù)稀釋倍數(shù)和平板上的菌落數(shù)來計(jì)算活菌數(shù)（cfu／m L）。
1．2．4菌液純檢收獲菌液的同時(shí)取少量菌液進(jìn)行普通營養(yǎng)瓊脂平板劃線培養(yǎng)，于37℃培養(yǎng)48 h，觀察有無雜菌長出，以判定菌液在培養(yǎng)期間是否被污染。
副雞禽桿菌生長曲線測定方法：分光光度法VS菌落計(jì)數(shù)法（一）
副雞禽桿菌生長曲線測定方法：分光光度法VS菌落計(jì)數(shù)法（二）
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