1.4.3不同培養(yǎng)條件下的生長曲線的測定
取純化后的細(xì)菌液體培養(yǎng)，菌液濃度達(dá)到1×108~5×108CFU/mL。取200μL的菌液和20 mL添加5%牛血清的THB液體培養(yǎng)基于錐形瓶中，在不同培養(yǎng)溫度（25、37、42℃）、培養(yǎng)基pH值（4~9）、鹽濃度（1%~5%）條件下測定0、2、4、6、8、10、12、14 h菌液OD600nm值，繪制生長曲線。
1.4.4常用消毒劑中和劑的篩選
將0.5%碘伏的中和劑設(shè)為0.5%硫代硫酸鈉+1%卵磷脂+1%吐溫80和0.5%硫代硫酸鈉+1%卵磷脂+3%吐溫80；0.2%新潔爾滅中和劑設(shè)為1%卵磷脂+1%吐溫80和1%卵磷脂+2%吐溫80；1 000 mg/L的84消毒液中和劑設(shè)為5%硫代硫酸鈉+1%卵磷脂+1%吐溫80和1%硫代硫酸鈉+2%卵磷脂+3%吐溫80；5%來蘇水中和劑設(shè)為3%吐溫80[16]。參照《消毒技術(shù)規(guī)范》[17]，設(shè)置6個試驗(yàn)組，分別為：消毒劑+菌懸液、消毒劑+菌懸液、中和劑+菌懸液、消毒劑+中和劑+菌液、稀釋液+菌懸液（陽性對照）、稀釋液+中和劑+培養(yǎng)基（陰性對照）。試驗(yàn)結(jié)果需符合第1組無菌生長，或僅有極少數(shù)分離株菌落生長；第2組有菌落生長，且較第1組為多，但較第3，4，5組少；第3~5組有相似量試驗(yàn)菌生長，其組間菌落數(shù)誤差率應(yīng)不超過15%；第6組無菌生長[18]。
1.4.5常用消毒劑對驢源馬鏈球菌馬亞種殺菌率的檢測
取0.5 mL菌懸液、0.5 mL 3%牛血清白蛋白加入試管，混勻，置20℃水浴5 min后，加入不同濃度消毒液4.0 mL注入其中，迅速混勻并立即計時。至各預(yù)定時間后分別吸取0.5 mL混合液加于4.5 mL中和劑，混勻。作用10 min后，吸取1.0 mL混合液，按平板計數(shù)方法測定存活菌數(shù)，每管混合液接種2個培養(yǎng)基。陽性對照組用稀釋液代替消毒劑溶液，所得結(jié)果代表菌液原有濃度。消毒劑試驗(yàn)設(shè)計見表1。消毒劑殺菌率的計算公式如下：
表1消毒劑試驗(yàn)分組
2結(jié)果與分析
2.1病原菌分離純化及生化特性
從發(fā)病驢和死亡驢的下頜膿汁和死亡驢肺部膿汁共分離到4株菌，XJ201901為死亡驢下頜膿汁分離，XJ201902為死亡驢肺部分離，XJ201903和XJ201904為發(fā)病驢下頜膿汁分離。
由圖1可知，4株菌均為革蘭氏陽性，長鏈狀球菌，β溶血。
圖1分離菌鏡檢及血平板培養(yǎng)情況
由表2可知，4株分離菌生化鑒定結(jié)果均為馬鏈球菌馬亞種，置信度94%。
表2分離株生化鑒定結(jié)果
2.2 PCR鑒定結(jié)果
圖2 seM基因PCR鑒定
4株分離菌提取基因組DNA后，用seM基因特異性引物擴(kuò)增seM基因片段。由圖2可知，擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)核酸電泳后可觀察到1條長約542 bp的片段，經(jīng)過測序?qū)Ρ确治?，結(jié)果顯示其序列與NCBI中登錄的驢源馬鏈球菌馬亞種seM基因序列（MH973488.1）同源性均超過99%，說明4株分離菌株均為馬鏈球菌馬亞種。
2.3分離菌株不同培養(yǎng)條件下的生長特性（見圖3~圖5）
由圖3可知，4株分離菌在不同溫度下生長情況明顯不同，37℃條件下細(xì)菌生長迅速，4 h進(jìn)入對數(shù)期并在8 h達(dá)到高峰，菌量可達(dá)108CFU/mL，8~14 h基本處于平臺期。25℃條件下細(xì)菌生長緩慢，培養(yǎng)10 h后才有明顯生長。42℃條件下，分離株比37℃早一步進(jìn)入對數(shù)期，在6 h達(dá)到高峰，但總菌量低于37℃，平臺期維持時間較短，8 h之后快速進(jìn)入衰亡期。
圖3不同溫度條件下4株分離菌生長曲線
由圖4可知，4株分離菌在4%及5%鹽濃度時不生長。1%和2%鹽濃度4 h進(jìn)入對數(shù)期，8~12 h處于平臺期，12 h后細(xì)菌開始衰亡，生長趨勢一致，但是2%鹽濃度下細(xì)菌總量低于1%鹽濃度3%鹽濃度條件下細(xì)菌生長緩慢12~14 h才達(dá)到其最大值。
圖4不同鹽濃度條件下4株分離菌生長曲線
由圖5可知，4株分離菌在pH值為4、5、9時不生長；pH值為7、8時，細(xì)菌生長情況基本一致；但pH值為8條件下，細(xì)菌在衰亡期的下降要快于pH值為7的條件；pH值為6時，細(xì)菌生長緩慢，菌量始終顯著低于pH值7、8。
圖5不同pH值條件下4株分離菌生長曲線
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