本文以水溶性苦蕎蛋白為研究對(duì)象，利用體外模擬發(fā)酵，通過對(duì)苦蕎蛋白作用下小鼠糞便發(fā)酵液中pH、短鏈脂肪酸(乙酸、丙酸、丁酸、乳酸)的含量以及有害菌(腸球菌、腸桿菌、產(chǎn)氣莢膜梭菌)的數(shù)量進(jìn)行測(cè)定，對(duì)苦蕎蛋白抑制腸道有害菌群生長(zhǎng)機(jī)理進(jìn)行了初步研究。結(jié)果表明:添加不同濃度的苦蕎蛋白與對(duì)照組相比，均可以有效降低有害菌的數(shù)量，其中高劑量組分別使腸球菌、腸桿菌和產(chǎn)氣莢膜梭菌減少了65%、72%和78%(32 h);同時(shí)，不同劑量組的苦蕎蛋白使小鼠糞便發(fā)酵液pH分別下降了35%、39%、40%(32 h)。此外，高劑量組的苦蕎蛋白較對(duì)照組分別使乙酸、丙酸、丁酸及乳酸的濃度增加了8.94、33.77、27.34、25.55倍(32 h)。綜上所述，苦蕎蛋白能夠提高腸道中短鏈脂肪酸含量，從而降低腸道環(huán)境的pH，抑制腸道有害菌(腸球菌、腸桿菌、產(chǎn)氣莢膜梭菌)的生長(zhǎng)。
腸道菌群被認(rèn)為是機(jī)體的一個(gè)重要“器官”，其組成和數(shù)量在維持人體健康中起重要作用，且主要由益生菌和有害菌(條件致病菌和病原菌)組成。而有害菌是腸道中的非優(yōu)勢(shì)菌群，其在腸道中只占較少的比例，其中腸球菌、腸桿菌以及產(chǎn)氣莢膜梭菌等是腸道中主要的有害菌，它們能夠?qū)⑹澄镏械囊恍┏煞肿優(yōu)槎喾N腐敗物質(zhì)(如:胺、吲哚、酚類)、有毒及致癌物質(zhì)(如:微生物毒素、硝基化合物)等，從而引起某些腸道疾病的發(fā)生。研究發(fā)現(xiàn)，花生蛋白對(duì)腸球菌、腸桿菌、產(chǎn)氣莢膜梭菌的生長(zhǎng)具有明顯的抑制作用。目前，對(duì)于苦蕎蛋白的研究主要集中在降低膽固醇、調(diào)節(jié)血脂以及其對(duì)益生菌增殖作用等方面，而對(duì)于其在腸道有害菌方面的研究則鮮有報(bào)道。
因此，本文以苦蕎蛋白為研究對(duì)象，通過模擬結(jié)腸發(fā)酵進(jìn)行體外培養(yǎng)，從苦蕎蛋白對(duì)腸道有害菌(腸球菌、腸桿菌、產(chǎn)氣莢膜梭菌)的生長(zhǎng)的抑制影響、小鼠糞便發(fā)酵液pH以及短鏈脂肪酸(乙酸、丙酸、丁酸、乳酸)的含量三個(gè)方面研究其對(duì)腸道有害菌生長(zhǎng)及抑制作用的機(jī)理。
1材料與方法
1.1材料
黑豐1號(hào)苦蕎購(gòu)于山西省左云縣;SPF級(jí)C57BL/6小鼠45只購(gòu)于上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司;L-半胱氨酸鹽酸鹽、膽鹽、維生素K1、氯高鐵血紅素、刃天青、胃蛋白酶(≥3000 U/g)、胰酶(≥4000 U/g)、豬膽汁粉，均為BR級(jí)購(gòu)于上海寶曼生物科技有限公司;伊紅美藍(lán)瓊脂(EMB)、胰月示-亞硫酸鹽-環(huán)絲氨酸瓊脂基礎(chǔ)、膽汁七葉苷疊氮鈉、D-環(huán)絲氨酸、50%卵黃乳液購(gòu)于青島海博生物技術(shù)有限公司;乙酸、丙酸、丁酸、乳酸，均為色譜純購(gòu)于上海麥克林生化科技有限公司;酪蛋白、葡萄糖、蛋白胨、酵母膏，均為AR級(jí)購(gòu)于國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑(上海)有限公司;其他試劑均為分析純。
體外模擬基礎(chǔ)培養(yǎng)基的制備(1 L):參考Mao Sheng-yong等人的方法，并略作修改。
PBS:磷酸鹽緩沖液(Phosphate Buffered Saline)，分別配制0.01 mol/L和0.1 mol/L、pH7.0的PBS。其中將配制好的PBS(0.1 mol/L，pH7.0)經(jīng)高壓滅菌后，置于厭氧培養(yǎng)箱中37℃過夜，用于稀釋腸道內(nèi)容物。
1.2實(shí)驗(yàn)方法
1.2.1實(shí)驗(yàn)小鼠分組
SPF級(jí)C57BL/6小鼠購(gòu)買后于SPF級(jí)動(dòng)物房?jī)?nèi)單籠飼養(yǎng)，飼養(yǎng)溫度(25±1.0)℃，濕度50%±1.0%RH，并喂食2周以適應(yīng)環(huán)境。在此期間，自由進(jìn)食和飲水(飲用水121℃、20 min滅菌，基礎(chǔ)飼料和墊料紫外照射30 min殺菌)。然后，將小鼠隨機(jī)分為五組，空白對(duì)照組喂食基礎(chǔ)飼料，酪蛋白組喂食酪蛋白添加量1 mg/mL的飼料，其余三組小鼠按苦蕎蛋白添加量1、3、5 mg/mL將小鼠分為低、中、高劑量組。
1.2.2苦蕎蛋白的制備
參考郭曉娜等人的方法并略作修改?？嗍w籽粒粉碎后過篩，脫脂24 h;取100 g脫脂苦蕎粉以料液比1∶10用0.01 mol/L，pH7.0的PBS溶解，在磁力攪拌器上攪拌2 h;在4℃條件下，4000 r/min離心30 min，并向上清液中加入(NH4)2SO4使其濃度為40%，攪拌60 min;在4℃條件下，10000 r/min離心15 min，并向上清液中加入(NH4)2SO4使其濃度為80%，攪拌60 min;在4℃條件下，10000 r/min離心15 min，棄上清，沉淀用少量去離子水復(fù)溶;然后將其加入到透析袋中進(jìn)行透析48 h(每4 h換水一次)，透析后進(jìn)行凍干(-70℃，24 h)，凍干粉保存?zhèn)溆谩?
1.2.3苦蕎蛋白含量的測(cè)定
參照國(guó)標(biāo)GB 50095-2010中凱氏定氮法進(jìn)行樣品測(cè)定。
1.2.4腸胃道環(huán)境模擬
體外消化:參考Mills等人的方法并略作修改。具體如下:分別稱取5.0 g苦蕎蛋白，將pH調(diào)節(jié)到2.0±0.05(此時(shí)胃蛋白酶的活性最高)，加入2.5 mL溶解在0.1 mol/L鹽酸中的胃蛋白酶溶液(0.108 g/mL)，經(jīng)37℃恒溫水浴震蕩2 h;經(jīng)過模擬胃部條件消化后，再用6 mol/L NaOH將溶液的pH調(diào)節(jié)到6.8±0.05(此時(shí)胰酶活性最高)，加入12.5 mL溶解在0.5 mol/L Na2CO3中的胰酶膽汁溶液(胰酶和膽汁濃度分別為4.5 mg/mL和28 mg/mL)，37℃恒溫水浴震蕩2 h;進(jìn)一步模擬食物在腸道中的消化。充分混勻后，將混合液置于透析袋進(jìn)行透析，并于37℃，在10 mmol/L NaCl溶液中進(jìn)行透析過夜，結(jié)束后，再次更換NaCl溶液并繼續(xù)透析2 h，最后將截留消化液進(jìn)行冷凍干燥，于4℃冰箱保存用于體外模擬腸道發(fā)酵實(shí)驗(yàn)。上述步驟以酪蛋白(Casein)作為對(duì)照以及用無菌水代替苦蕎蛋白作為空白對(duì)照。
1.2.5體外發(fā)酵液的制備
體外發(fā)酵:參考Estibaliz等人的方法，并略作修改。向無菌發(fā)酵瓶中加入90 mL基礎(chǔ)培養(yǎng)基并于厭氧工作站中37℃進(jìn)行預(yù)還原(12 h)。1 L基礎(chǔ)培養(yǎng)基中含有:2 g葡萄糖，2 g蛋白胨，2 g酵母膏，0.1 g NaCl，0.04 g K2HPO4，0.04 g KH2PO4，0.01 g MgSO4·7H2O，0.01 g CaCl2·6H2O，2 g NaHCO3，0.5 gL-半胱氨酸鹽酸鹽，0.5 g膽鹽，10 mL維生素K1，2 mL吐溫-80和1 mL氯高鐵血紅素溶液，將以上成分溶解后調(diào)節(jié)基礎(chǔ)培養(yǎng)基pH至7.0(±0.05)，最后加入4 mL 0.025%(w/v)刃天青溶液并滅菌。
收集小鼠新鮮糞便(盡量保持無菌狀態(tài))，收集后立即用預(yù)還原的磷酸鹽緩沖溶液(PBS，0.1 mol/L，pH7.0)稀釋10倍，并在渦旋振蕩器上充分振蕩3 min，使之徹底勻漿化，500 r/min離心2 min，分別迅速取上清液10 mL到90 mL預(yù)還原基礎(chǔ)培養(yǎng)基中，再加入低(0.2 g)、中(0.4 g)、高劑量組(0.8 g)經(jīng)胃腸模擬環(huán)境處理后的苦蕎蛋白水解樣品BWPH(酪蛋白消化凍干樣品PC作為對(duì)照組，無菌水代替苦蕎蛋白的消化凍干產(chǎn)物CK作為空白對(duì)照)充分混勻;在厭氧培養(yǎng)箱中37℃發(fā)酵32 h，并在發(fā)酵的第0、8、16、32 h取樣。
1.2.6苦蕎蛋白對(duì)三種有害菌生長(zhǎng)的影響
在發(fā)酵的第0、8、16、32 h，分別取小鼠糞便發(fā)酵液并對(duì)其中的腸球菌、腸桿菌、產(chǎn)氣莢膜桿菌進(jìn)行計(jì)數(shù)，發(fā)酵液用含有5 g/L蛋白胨的稀釋液進(jìn)行10倍梯度法稀釋(10-1～10-7)，選擇合適稀釋度的樣品(100μL)并分別涂布于各選擇性培養(yǎng)基上進(jìn)行培養(yǎng)(培養(yǎng)基、培養(yǎng)方法及條件，見表1)，以上操作均在厭氧培養(yǎng)箱中進(jìn)行，從取樣至涂板完成所用時(shí)間控制在3 h內(nèi)。每毫升小鼠糞便發(fā)酵液的菌落數(shù)用菌落形成單位的以10為底的對(duì)數(shù)值(lg CFU/mL)表示。
表1腸道主要菌群培養(yǎng)計(jì)數(shù)方法
1.2.7苦蕎蛋白對(duì)發(fā)酵液pH的影響
在發(fā)酵的第0、8、16、32 h，分別取不同樣品小鼠糞便發(fā)酵液，用pH計(jì)測(cè)定其pH。
1.2.8苦蕎蛋白對(duì)短鏈脂肪酸的影響
短鏈脂肪酸(SCFAs)是腸道微生物發(fā)酵不被人體胃腸道吸收的食物成分而生成的代謝產(chǎn)物，主要包括甲酸、乙酸、丙酸、丁酸、乳酸、延胡索酸和一些相應(yīng)的支鏈脂肪酸。其中乙酸、丙酸、丁酸及乳酸占90%以上，具有重要的生理功能。為進(jìn)一步研究苦蕎蛋白對(duì)腸道有害菌群生長(zhǎng)抑制作用的機(jī)理，實(shí)驗(yàn)對(duì)小鼠糞便發(fā)酵液中短鏈脂肪酸(SCFAs)的濃度變化進(jìn)行分析。
在發(fā)酵的第0、8、16、32 h，分別取不同樣品小鼠糞便發(fā)酵液，采用氣質(zhì)聯(lián)用(GC-MS-MS)法測(cè)定其中短鏈脂肪酸(SCFAs，包括乙酸、丙酸、丁酸、乳酸)的含量。
氣質(zhì)分析條件:毛細(xì)管柱(Rtx-5MS，30 m×0.25 mm×0.25μm);柱溫:35℃保持1 min，以10℃/min的速度升溫至100℃，保持1 min，再以20℃/min的速度升溫至250℃，保持3 min;進(jìn)樣口溫度:250℃;離子源溫度:220℃;接口溫度:260℃;分流方式及分流比:分流進(jìn)樣和10∶1;載氣:He，流速:1 mL/min;溶劑延遲1.5 min。GC分析時(shí)進(jìn)樣量:1μL。
發(fā)酵液樣品的處理參考Fenster等人的方法，并略作修改。
1.2.9數(shù)據(jù)分析
采用SPSS 20.0軟件進(jìn)行ANOVA(LSD檢驗(yàn))，檢驗(yàn)水準(zhǔn)=0.05進(jìn)行顯著性分析;每組數(shù)據(jù)均作3個(gè)平行樣，結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，并運(yùn)用origin 9.0軟件進(jìn)行作圖。
苦蕎蛋白對(duì)腸球菌、腸桿菌、產(chǎn)氣莢膜梭菌生長(zhǎng)抑制作用及機(jī)理（一）
苦蕎蛋白對(duì)腸球菌、腸桿菌、產(chǎn)氣莢膜梭菌生長(zhǎng)抑制作用及機(jī)理（二）
相關(guān)新聞推薦
1、明永冰川地區(qū)低溫黃桿菌噬菌體生長(zhǎng)曲線繪制及生物學(xué)特性（四）
2、枯草芽孢桿菌的晝夜波動(dòng)生長(zhǎng)與根際溶解氧和pH值密切相關(guān)
3、高密度發(fā)酵的過程中乙酸抑制重組大腸桿菌生長(zhǎng)及外源基因的表達(dá)——材料與方法
4、南農(nóng)大在植物生長(zhǎng)促進(jìn)細(xì)菌-植物-微生物組互作關(guān)系方面取得新進(jìn)展