3、討論


在抗生素廣泛使用的今天，細(xì)菌耐藥性已然成為21世紀(jì)人類健康最大的威脅之一。而噬菌體在替代抗生素進(jìn)行細(xì)菌性疾病的治療方面有很大的應(yīng)用潛力。目前文獻(xiàn)報(bào)道的噬菌體大部分屬于有尾噬菌體目，其最大特點(diǎn)就是有與宿主識(shí)別和核酸注射有關(guān)的尾部。而有尾噬菌體目包括短尾噬菌體科(Podoviridae)、肌尾噬菌體科(Myohoviridae)和長尾噬菌體科。Lin等和張建城的研究中所分離得到的溶藻弧菌噬菌體屬于短尾噬菌體科；付漢清等和歐陽敏等分離得到的溶藻弧菌噬菌體屬于肌尾噬菌體科；本研究分離得到的溶藻弧菌噬菌體φV039C在分類上應(yīng)屬于長尾噬菌體科，其擁有長且靈活的尾部。溶藻弧菌的噬菌體尾部形態(tài)多樣，對(duì)噬菌體的吸附與侵染具有重要作用，同時(shí)也是分類上非常重要的判斷依據(jù)。


噬菌體φV039C的基因組與數(shù)據(jù)庫中已知的基因組相似區(qū)覆蓋率較低，是一株完全新型的噬菌體。在φV039C的基因組注釋出的74個(gè)ORF中，有20個(gè)是已知功能的ORF(占比27%)，其余為未知功能的假想蛋白。而據(jù)于浩、沈嬋娟、江莉莎等、韋德源等的報(bào)道，其研究對(duì)象——根瘤菌、嗜水氣單胞菌、分歧桿菌、大腸桿菌的噬菌體基因組中已知功能的ORF占比分別為18%、25%、34%、44%，這說明大部分噬菌體還存在許多未知功能的基因。


大多數(shù)烈性噬菌體的遺傳物質(zhì)中都有與編碼復(fù)制相關(guān)的酶的區(qū)域。同樣，噬菌體φV039C已知功能ORF中也有多個(gè)與DNA復(fù)制調(diào)控、核酸代謝有關(guān)的ORF(ORF1、ORF49、ORF57、ORF58、ORF65等)，這些蛋白幫助其遺傳物質(zhì)進(jìn)入宿主細(xì)胞后利用宿主的酶系統(tǒng)進(jìn)行自身遺傳物質(zhì)的復(fù)制和蛋白的表達(dá)。其中，ORF49(交叉連接內(nèi)脫氧核糖核酸酶)能夠水解宿主細(xì)胞內(nèi)的脫氧核糖核酸，以便為噬菌體合成DNA提供脫氧核糖核苷酸。


噬菌體的基因組有多種類型，分別為ssDNA、dsDNA、ssRNA、dsRNA。本研究中噬菌體φV039C基因組類型屬于dsDNA，而dsDNA噬菌體組裝的重要步驟就是將DNA緊緊包裹在衣殼中。這一過程需要大亞基終止酶、小亞基終止酶和通道蛋白組合成一個(gè)“DNA包裝機(jī)”來協(xié)助完成。另外，通道蛋白還能夠幫助噬菌體在自身衣殼中形成通道，使其能夠更好地將自己的基因組注射到宿主細(xì)胞中。噬菌體φV039C的ORF19和ORF25分別編碼大亞基終止酶和通道蛋白，但是未發(fā)現(xiàn)編碼小亞基終止酶的ORF。


噬菌體可用于分類的形態(tài)特征太少，同源基因也不多。裂解酶是噬菌體中比較常見的一類基因，在分類上具有重要的價(jià)值。裂解酶根據(jù)作用方式可以分為三種，分別是溶菌酶、酰胺酶和內(nèi)肽酶。高明明等分離到的肺炎克雷伯菌噬菌體的裂解系統(tǒng)僅有一個(gè)相關(guān)基因ORF48(細(xì)胞內(nèi)溶素)，屬于溶菌酶。溶菌酶是常見的裂解酶，其作用方式是作用于細(xì)菌細(xì)胞壁上的肽聚糖，增加其溶解性，使細(xì)胞由內(nèi)部破裂，釋放子代噬菌體。本研究中噬菌體φV039C的裂解系統(tǒng)也僅有一個(gè)相關(guān)基因，即ORF6(N-乙酰壁氨酰-L-丙氨酸酰胺酶)，屬于酰胺酶，其作用方式是水解細(xì)胞壁中的N-乙酰胞壁酸和L-丙氨酸之間的酰胺鍵，從而使宿主細(xì)胞破裂，釋放子代噬菌體。此外，噬菌體因其宿主特異性較高，在實(shí)際應(yīng)用中有較大的限制，而裂解酶的宿主特異性較小，因此越來越多的學(xué)者開始專注于噬菌體裂解酶的研究及裂解酶的克隆表達(dá)。


噬菌體φV039C的結(jié)構(gòu)蛋白中，ORF28和ORF29分別編碼次要衣殼蛋白和主要衣殼蛋白。衣殼蛋白作為噬菌體的外殼，能夠緊緊地包裹住噬菌體的遺傳物質(zhì)。因其編碼序列具有高度的保守性，所以也常用于噬菌體的分類。ORF39(尾部裝配配子)和ORF40(卷尺測(cè)量蛋白)與尾部的裝配以及部分功能有關(guān)，卷尺測(cè)量蛋白能夠在噬菌體尾部伸縮時(shí)控制尾部的長度。


雖然噬菌體在自然界豐度極高(據(jù)估計(jì)超過1031個(gè))，但是目前NCBI Genome數(shù)據(jù)庫中僅有9000余條噬菌體完整基因組，且沒有對(duì)應(yīng)宿主的基因組信息，因此噬菌體在基因組及其功能注釋的研究方面還存在很多未知領(lǐng)域。本文對(duì)分離得到的一株新型溶藻弧菌噬菌體φV039C進(jìn)行生物學(xué)特性和全基因組的研究，對(duì)探索噬菌體未知領(lǐng)域，以及進(jìn)一步將噬菌體投入到實(shí)際應(yīng)用提供了重要的理論依據(jù)。


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