醬香型白酒堆積發(fā)酵過程中的真菌群落極為豐富，涵蓋了多個真菌門和屬。據(jù)研究，子囊菌門在醬香型白酒的堆積過程中占據(jù)了主導(dǎo)地位，其相對豐度高達(dá)95%以上。此外，還有包括擔(dān)子菌門、接合菌門等在內(nèi)的其他真菌門也被檢測到。在屬水平上，更是存在數(shù)百個真菌屬，其中一些屬的相對豐度在堆積過程中超過了1%。
這些真菌群落的存在，為堆積發(fā)酵過程提供了豐富的酶系和代謝產(chǎn)物，對于白酒的品質(zhì)和風(fēng)味具有重要影響。它們能夠分解原料中的淀粉、蛋白質(zhì)等大分子物質(zhì)，產(chǎn)生多種有機(jī)酸和酯類物質(zhì)，這些物質(zhì)是白酒香氣和風(fēng)味的主要來源。
醬香型白酒堆積酒醅的優(yōu)勢真菌及演替規(guī)律
為探究導(dǎo)致真菌群落多樣性隨時間序列變化的微生物原因，進(jìn)一步分析了堆積過程中微生物結(jié)構(gòu)的演替規(guī)律。堆積過程中的優(yōu)勢真菌屬（平均相對豐度>1%）有畢赤酵母屬（Pichia，平均相對豐度82.75%）、釀酒酵母屬（Saccharomyces，5.75%）、嗜熱子囊菌（Thermoascus，2.75%）、曲霉屬（Aspergillus，2.25%）和紅曲霉屬（Monascus，1.12%）等。畢赤酵母是酒類發(fā)酵過程中常見的非釀酒微生物，具有產(chǎn)酯的作用，對白酒的風(fēng)味有重要貢獻(xiàn)[22]。釀酒酵母是十分重要的乙醇產(chǎn)生工業(yè)微生物，直接關(guān)系到其發(fā)酵酒精的產(chǎn)量多少和質(zhì)量的好壞。堆積過程中畢赤酵母和釀酒酵母的比例持續(xù)增加，堆積結(jié)束時畢赤酵母占據(jù)絕對優(yōu)勢（86.95%~94.98%）。以上結(jié)果暗示了非釀酒酵母對醬香型白酒造沙輪次的發(fā)酵群落構(gòu)建起到重要作用[23]。此外，4個班組微生物演替的總體趨勢一致，但仍存在明顯差異。我們推測這可能是由于醬香型白酒目前仍然采用傳統(tǒng)的釀造方式，各班組的工藝參數(shù)控制主要依靠工人師傅的生產(chǎn)經(jīng)驗(yàn)，這也導(dǎo)致堆積酒醅理化指標(biāo)的差異；這種由工藝參數(shù)控制引起的環(huán)境壓力差異也會對堆積過程中不同來源的微生物篩選產(chǎn)生差異。因此，即使在醬香型白酒生產(chǎn)的核心產(chǎn)區(qū)，仍然出現(xiàn)釀造微生物的差異及發(fā)酵質(zhì)量的波動。
盡管堆積發(fā)酵過程中霉菌比例較低，但多樣化的霉菌能夠產(chǎn)生木聚糖酶、淀粉酶、蛋白酶及酯化酶等酶類[24]，是釀酒生產(chǎn)前期降解發(fā)酵原料中淀粉等大分子物質(zhì)的主要動力[25]。除此之外，霉菌生長代謝過程中還產(chǎn)生一些呈香物質(zhì)，對產(chǎn)酒具有積極的貢獻(xiàn)。值得關(guān)注的是，本研究中酵母菌的多樣性低于與WU等[21]報道的關(guān)于醬香型白酒酵母菌多樣性。我們推測產(chǎn)生這種差異的原因可能是本研究為醬香型白酒的造沙輪次，取樣季節(jié)為冬季，較低的溫度導(dǎo)致參與發(fā)酵的微生物種群多樣性較低，也說明不同季節(jié)的環(huán)境微生物對酒醅中真菌種群結(jié)構(gòu)都有較大影響[26]。基于醬香型白酒多輪次的發(fā)酵工藝，不同輪次的環(huán)境微生物群落特征還有待進(jìn)一步解析，環(huán)境微生物如何影響不同輪次發(fā)酵質(zhì)量也有待進(jìn)一步研究。
醬香型白酒生產(chǎn)用大曲和環(huán)境真菌群落的結(jié)構(gòu)分析
由圖1環(huán)境樣品的聚類圖可知，大曲、室內(nèi)環(huán)境（室內(nèi)走廊、堆積地面、工具和窖池地面等）與室外環(huán)境（室外地面和車間窗臺等）的真菌微生物群落分布具有明顯的差異。其中，嗜熱子囊菌屬（Thermomyces）、嗜熱絲孢菌屬（Thermoascus）和曲霉菌屬（Aspergillus）在大曲中占主導(dǎo)地位；而畢赤酵母（Pichia，<1%）和釀酒酵母（Saccharomyces，<0.1%）的相對豐度非常低，平均豐度均小于1%，屬于稀有微生物種類。相比之下，畢赤酵母以工具表面和室內(nèi)地面為主，其次是假絲酵母屬（Candida）、有孢圓酵母屬（Torulaspora）和威克漢姆酵母屬（Wickerhamomyces）。從微生物分布來看，發(fā)酵相關(guān)真菌在不同環(huán)境中的分布更廣泛和普遍，工人的微生物主要是假絲酵母屬（Candida）和畢赤酵母屬（Pichia）；堆積地面和工具中含有較多的發(fā)酵相關(guān)的酵母類微生物，可能是環(huán)境影響發(fā)酵過程的關(guān)鍵類群。未鑒定的微生物和其他非發(fā)酵微生物在空氣和室外地面樣品的豐度更高。以上結(jié)果表明，環(huán)境樣品中微生物的相對豐度存在較大的差異，進(jìn)一步體現(xiàn)了發(fā)酵環(huán)境的復(fù)雜性和多變性。
醬香型白酒堆積酒醅、大曲及環(huán)境樣品的真菌群落比較
醬香型白酒生產(chǎn)用大曲中顯著富集的真菌微生物
進(jìn)一步分析醬香型白酒堆積酒醅、大曲和環(huán)境樣品中的真菌結(jié)構(gòu)。圖2-a展示了與環(huán)境樣品相比，在大曲中顯著富集的真菌微生物（大曲OTUs）。如圖所示，大曲中顯著富集了70種真菌OTU（紫色圓圈表示），占優(yōu)勢的OTU歸屬于扣囊復(fù)膜孢酵母（Saccharomycopsis fibuligera）、紫色紅曲霉（Monascus purpureus）、伯頓絲孢畢赤氏酵母（Hyphopichia burtonii）、絲毛紅曲菌（Monascus pilosus）和Rasamsonia composticola等，表明大曲對這些微生物群落高度的選擇。我們進(jìn)一步計(jì)算了大曲中顯著富集的OTU總相對豐度，結(jié)果揭示了這些微生物在堆積酒醅、大曲和環(huán)境樣品的顯著差異，大曲中顯著富集的微生物在酒醅、環(huán)境和大曲中的平均相對豐度分別為3.10%、3.90%和44.19%（圖2-b）。最后，解析了大曲中顯著富集微生物的屬水平分類信息（圖2-c），結(jié)果表明大曲中顯著富集的微生物包括扣囊復(fù)膜孢酵母屬（Saccharomycopsis）、紅曲霉屬（Monascus）、嗜熱子囊菌屬（Thermoascus）以及曲霉屬（Aspergillus）等。
醬香型白酒堆積酒醅中顯著富集的真菌微生物
堆積發(fā)酵的酒醅同時從大曲和環(huán)境中富集真菌微生物。圖2-a展示了堆積酒醅從環(huán)境和大曲中顯著富集的真菌微生物共16種。這些顯著富集的優(yōu)勢OUT歸屬為庫德畢赤酵母（Pichia kudriavzevii）、釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）、釀酒酵母/奇異酵母（Saccharomyces CF.cerevisiae/Paradoxus）和嗜熱子囊菌（Thermoascus crustaceus）等。通過計(jì)算這些OTU的總相對豐度，發(fā)現(xiàn)他們在各類樣品中的分布為大曲中9.05%，環(huán)境中14.43%，堆積酒醅中85.06%（圖2-b）。進(jìn)一步分析酒醅中顯著富集的真菌OTU的屬水平分類信息（圖2-c），結(jié)果表明，這些微生物主要屬于酵母類的微生物如畢赤酵母和釀酒酵母等，并且這些微生物在環(huán)境中的比例遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于在大曲中的比例。以上結(jié)果表明酵母類的微生物主要通過環(huán)境自然接種并參與發(fā)酵過程，表明環(huán)境在醬香型白酒的固態(tài)發(fā)酵過程中的重要作用。
醬香型白酒堆積發(fā)酵酒醅微生物的溯源分析
使用貝葉斯概率工具SourceTracker[20]來計(jì)算發(fā)酵酒醅中的微生物的來源和比例。不同班組的堆積起始的酒醅中真菌微生物具有相似的來源，主要包括大曲（平均貢獻(xiàn)比例33.14%）、堆積地面（平均貢獻(xiàn)比例37.49%）和工具（平均貢獻(xiàn)比例29.22%）等。但不同車間之間微生物來源的比例略有差異：大曲微生物對發(fā)酵酒醅的貢獻(xiàn)比例為15%~47%，堆積地面貢獻(xiàn)比例為27%~43%，而工具貢獻(xiàn)比例為15%~41%。其他的環(huán)境類別包括室內(nèi)地面、封窖泥、室外環(huán)境、原料、工人和空氣等對堆積起始酒醅微生物結(jié)構(gòu)的影響較小。
SourceTracker軟件還預(yù)測了堆積發(fā)酵酒醅中功能真菌的來源，其中堆積發(fā)酵酒醅中最豐富的酵母屬最常見來源是堆積地面和工具。堆積發(fā)酵過程中富集了較多的畢赤酵母。Pichia kudriavzevii主要由堆積地面（18.6%~33.0%）和工具（9%~35%）共同貢獻(xiàn)，貢獻(xiàn)比例遠(yuǎn)大于大曲（2.5%~6.5%）。Saccharomyces cerevisiae主要來自于堆積地面（3%~6.6%）和工具（0.06%~3.5%）。作為非釀酒酵母，畢赤酵母已被證明對醬香型白酒微生物態(tài)的塑造具有重要的意義。本研究進(jìn)一步揭示了醬香型白酒核心產(chǎn)區(qū)環(huán)境微生物對優(yōu)質(zhì)醬香型白酒發(fā)酵的獨(dú)特貢獻(xiàn)。
除了釀造環(huán)境的接種作用，大曲是堆積酒醅中功能微生物的另一個重要來源。大曲對堆積酒醅主要貢獻(xiàn)了嗜熱子囊菌（Thermoascus aurantiacus、5%~10%）和阿姆斯特丹曲霉（Aspergillus amstelodami）。這些微生物可能對于堆積過程的糖化發(fā)酵起到重要作用，表明大曲貢獻(xiàn)了堆積初始糖化的主要功能菌群。
小結(jié)：醬香型白酒的釀造環(huán)境對真菌群落的構(gòu)成和變化具有重要影響。不同的釀造環(huán)境，如溫度、濕度、原料組成等因素，都會影響真菌群落的生長和繁殖。此外，釀造環(huán)境中的微生物群落也會影響真菌群落的構(gòu)成和變化。例如，在堆積發(fā)酵過程中，細(xì)菌群落的構(gòu)成和變化也會影響真菌群落的生長和繁殖。因此，在醬香型白酒的釀造過程中，需要合理控制釀造環(huán)境，確保真菌群落的正常生長和繁殖。
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